根系在植物生长过程中除了能从生长介质中摄取必需的养分和水分外，还可以向生长介质中主动或被动地分泌质子、离子和大量的有机物质，即根系分泌物(root exudates)(涂书新等，2010)。研究表明，根系分泌物成分复杂，主要包括一些低分子(有机酸、糖类、酚类和各种氨基酸等)和高分子(黏胶、胞外酶等)有机化合物。同时，作为根际生态过程的关键驱动要素，根系分泌物在生物地球化学循环、根系生态过程调控、植物生长发育等方面都具有重要的作用(吴林坤等，2014)。目前，有关森林根系分泌物的研究主要聚焦于根系分泌物输入对土壤C-养分循环过程的影响(Yin et al., 2013; Brzostek et al., 2013; Cheng et al., 2014)，而有关森林根系分泌物输入对林下物种更新和多样性的潜在生态学效应研究较少。目前仅局限于分析森林根系和根际土壤水浸液对地被层植物生长状况的影响(段剑等，2015；陆茜等，2017)，这与森林根系通过次生代谢输入的分泌物所产生的影响有很大差别(陈龙池等，2003)。

化感物质可通过作用于植物的不同生长发育阶段而对植物产生影响，如影响种子萌发、幼苗生长发育、成株的开花结实及植被的形成与演替等，最终影响物种的更新(张茂新等，2002; Turk et al., 2003; 郑丽等，2005; Kong et al., 2006; Duke, 2007)。根系分泌物输入是土壤环境中化感物质的重要来源之一(Chon et al., 2002)，输入的酚酸类物质具有较强的化感活性，能引起植物自毒作用(Huang et al., 2000)。植物能通过根系向土壤中输入化感物质，从而对林下植物的种子萌发及幼苗生长产生直接或间接的抑制作用(孙婧珏等，2013)。研究树木根系分泌物及其化感效应，对科学合理的指导森林物种多样性恢复以及人工森林管理等有重要意义。但由于林木生长周期较长、生长环境复杂、根系分泌物收集困难等特点，其化感作用的研究远不如1年生禾本科(Gramineae)作物深入(孔垂华等，2004；张晓珂等，2004)，目前有关根系分泌物所介导的化感效应的研究已成为森林生态学领域的热点问题。

西南亚高山针叶林(subalpine coniferous forests)作为青藏高原东缘高寒森林的主体，对该区域水土保持、水源涵养、气候调节和生物多样性保育等方面具有重要的作用和地位(刘庆，2001)。前期调查显示，西南亚高山人工针叶林生物多样性低，林下物种群落结构较为单一(孟兆鑫，2007)。因此，本研究采用西南亚高山人工针叶林的主要造林树种粗枝云杉(Picea asperata)为研究对象，利用自制的装置野外原位收集粗枝云杉的根系分泌物，带回实验室后通过人工添加的方式探究根系分泌物输入对人工云杉林生境内2种草本植物白车轴草(Trifolium repens)和紫花苜蓿(Medicago sativa)种子萌发和幼苗生长的影响，为揭示根系分泌物对林下植被更新和群落多样性的潜在生态学效应提供参考。

1 材料和方法 1.1 试验设计

根系分泌物取样地位于中国科学院成都生物研究所茂县山地生态系统定位研究站(31°41′N, 103°53′E, 海拔1 820 m)，样地相关信息详见卫云燕等(2011)。室内种子萌发试验包括不含根系分泌物营养液(CK)与含根系分泌物营养液(RE)2个处理。

1.2 试验方法

1) 根系分泌物收集 于2014年7—8月份生长旺季，采用自制的装置原位收集粗枝云杉幼树的根系分泌物(图 1)。在每个样方随机选取3株长势良好的云杉幼树(树龄10年)，沿着其根系生长方向找1个未受损伤的细根(直径 < 2 mm，长20~30 cm), 用去离子水冲洗细根3次以除去附着杂质，再用装有不含C、N的营养液(0.1 mmol·L^-1 KH₂PO₄、0.2 mmol·L^-1 K₂SO₄、0.3 mmol·L^-1 CaCl₂·2H₂O和0.2 mmol·L^-1 MgSO₄·7H₂O)的喷壶将其冲洗干净，以防损伤细根。将洗净的细根转移入装有玻璃棉的针筒(防止抽滤时玻璃珠堵塞筒口)，细根装入后，将无菌玻璃珠小心装入针筒并同时注入10 mL营养液来保证根系的活性。营养液注入完成后盖上筒帽并用封口膜包裹针筒顶部(防止杂质流入针筒)，最后用泥土覆盖。间隔24 h后利用真空泵抽滤3次至棕色塑料瓶。每次抽滤结束后注入10 mL上述营养液继续培养，每次取样连续收集3天。同时以无根的培养装置作为对照，每个样方设3个重复(何为等，2017)。

2) 发芽率测定  2014年秋季在70年人工云杉林生境内采集白车轴草和紫花苜蓿种子，后选取其中形态相似且具有活性的种子放入纸袋中于暗处室温储存备用。每个处理随机挑取50粒外观一致、籽粒饱满的白车轴草和紫花苜蓿种子，将种子浸于0.2%高锰酸钾(KMnO₄)溶液20 min，并用纯净水洗净备用。然后在已消毒的培养皿(直径为9 cm)中铺双层滤纸，每个培养皿内均匀摆放50粒种子。每个处理培养皿加10 mL收集的RE溶液，对照培养皿则添加等量的CK溶液。将摆放好种子的培养皿置于光照培养箱中培养(温度：25 ℃；光照：12 h·d^-1)，此后每天中午向培养皿中补充2 mL RE与CK以保持培养皿内滤纸的湿度，试验重复3次。

种子着床培养次日为第1天，试验共计7天。每天观察并记录每个培养皿中种子发芽情况，计算种子发芽率、发芽势以及发芽指数。参照种子检验规程，以胚根突破种皮伸出2 mm为发芽标准计算其发芽率，以7天内的发芽种子数计算发芽势。发芽指数中G_t为在t天的种子发芽数; D_t为相对应的种子发芽天数。

发芽率(GP)= (发芽种子总数/供试种子粒数)× 100%；

发芽势(GE)=(规定时间内种子发芽总数/供试种子粒数)×100%；

发芽指数(GI)=Σ(G_t/D_t)。

3) 幼苗生物量测定 第7天发芽结束后每皿随机选取10株长势均一的代表性幼苗，称量其总鲜质量，然后置于105 ℃的烘箱中处理0.5 h，再调至70 ℃烘至恒质量，称总干质量。

4) 幼苗形态测定 第7天发芽结束后每皿随机选取10株长势均一的代表性幼苗，利用WINRHIZO图像分析软件(Régent instruments, Quebec, QC, Canada)进行形态扫描，统计得出10株幼苗的幼苗总长度、总表面积、总体积。

5) 根系分泌物中酚酸类物质检测 选取6种常见的化感作用明显的酚酸类物质(没食子酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸和肉桂酸)作为标准品(谢星光等，2014)。将标准品溶液和根系分泌物冷冻干燥浓缩液分别进样，采用超高效液相色谱质谱联用仪(UPLC-Xevo^TM TQ MS，Waters, USA)，根据质谱分子量和色谱保留时间等进行有效的分离和鉴定。色谱柱为反向C18柱ACQUITY UPLC BEH-C18(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)，柱温为50 ℃，以水和甲醇溶液为流动相，流速为0.4 mL·min^-1，进样量为2 μL。洗脱方式为85%水和15%甲醇(0~2 min)、70%水和30%甲醇(2~8 min)、30%水和70%甲醇(8~10 min)、5%水和95%甲醇(10 min以后)。

1.3 数据处理

试验测定结果参照Williamson等(1988)的方法计算化感作用效应指数RI。RI=(T₁-T₀)/T₀×100%，公式中T₁是测试项目的处理值，T₀为对照值。若RI＞0则为促进作用，若RI＜0则为抑制作用，其绝对值大小代表化感作用的相对强弱。同时采用化感综合效应指数(SE)表征根系分泌物化感作用的综合效应，SE用同一试验处理下种子的发芽率、发芽势、发芽指数、幼苗鲜质量、幼苗干质量、幼苗总长度、总表面积和总体积8个指标的化感效应指数(RI)算术平均值进行评价(沈慧敏等，2005)。数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析，利用独立样本T检验方法比较根系分泌物处理对2种草本种子萌发及幼苗生长影响的差异显著性。采用Origin 9.0制图，Microsoft Excel 2013制表。

2 结果与分析 2.1 根系分泌物处理对2种草本植物种子发芽特性的影响

云杉幼树根系分泌物处理降低了2种草本植物种子发芽率、发芽势和发芽指数，且紫花苜蓿种子处理间存在显著差异(图 2)。与对照相比，根系分泌物处理使白车轴草和紫花苜蓿种子的发芽率分别降低9.4%(P>0.05)和26.5%(P < 0.05) (图 2A)，种子发芽势分别降低了32.4%(P>0.05)和37.6%(P < 0.05)(图 2B)。同时，根系分泌物处理下2种草本种子的发芽指数分别降低了32.5%(P>0.05)和38.7%(P < 0.05) (图 2C)，由此可知，根系分泌物对于林下草本植物种子的发芽特性存在一定的抑制作用，并可能影响林下植被的更新和群落多样性。

2.2 根系分泌物处理对2种草本植物幼苗生物量的影响

云杉幼树根系分泌物处理降低了2种草本植物幼苗鲜质量和干质量(图 3)，且紫花苜蓿幼苗处理间差异显著。与对照相比，根系分泌物处理下白车轴草和紫花苜蓿幼苗的鲜质量分别降低10.4%(P>0.05)和29.1%(P < 0.05)(图 3A)。同时，根系分泌物处理造成2种草本植物幼苗干质量分别降低了3.7% (P>0.05)和17.2%(P < 0.05)(图 3B)，证明根系分泌物能够在一定程度上抑制林下草本植物的幼苗生长，并可能限制林下物种的更新与群落多样性的增加。

2.3 根系分泌物处理对2种草本植物幼苗形态特征的影响

云杉幼树根系分泌物处理降低了2种植物幼苗长度、表面积和体积，且影响的幅度有所差异(图 4)。相比对照，白车轴草和紫花苜蓿2种幼苗总长度分别降低了16.8%(P < 0.05)和11.9%(P < 0.05)(图 4A)，而总表面积分别降低了3.6%(P>0.05)和5.4%(P>0.05)(图 4B)，同时，根系分泌物处理下2种草本植物幼苗总体积分别降低了18.4%(P>0.05)和4.3%(P>0.05)(图 4C)，表明根系分泌物处理能够对林下草本植物的幼苗形态特征产生一定的抑制效应，并可能会对林下草本植物的更新和群落多样性造成影响。

2.4 根系分泌物处理对2种草本植物的化感效应指数分析

通过对云杉幼树根系分泌物处理下白车轴草和紫花苜蓿的化感效应指数(RI)和综合化感效应(SE)值的结果分析表明(表 1)，根系分泌物处理对2种草本植物的化感效应指数RI值均小于0，同时，根系分泌物处理下2种草本植物的综合化感效应SE值均小于0，表明根系分泌物添加对2种草本植物种子萌发和幼苗生长均起到抑制作用的化感效应。

2.5 根系分泌物UPLC-MS分析

通过UPLC-MS对云杉幼树根系分泌物与酚酸混合标准品的比对分析，并利用质谱分子量和色谱保留时间等方法鉴定后发现6种常见的酚酸类物质(没食子酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、阿魏酸和肉桂酸)在根系分泌物中均被检出，保留时间分别为1.57、3.53、3.91、4.38、5.24和7.76 min，证明云杉幼树根系分泌物中含有多种化感物质。

3 讨论

人工林普遍存在群落稳定性差、结构较为单一、地被层生物多样性低下的问题(马履一等，2007；王健敏等，2010)。目前有关人工林地被层生物多样性的研究主要集中在地上生态学过程，如林下光照林分密度和凋落物覆盖等(段文标等，2013；林开敏等，2001；刘芳黎等，2017)，而较少涉及到森林地下生态学过程对林下植被生物多样性的影响，这在一定程度上限制了人们对森林生态系统生态学过程的全面认识。目前，已有的少量有关森林地下生态学过程的研究，局限于分析森林根系和根际土壤水浸液对地被层植物生长状况的影响(段剑等，2015；陆茜等，2017)，而水浸液是通过溶液浸提林木根系和土壤得到，它与森林根系通过次生代谢分泌的有机物质有很大差别，仍然具有很大的不确定性(陈龙池等，2003)。本试验采用原位收集的手段，探究云杉根系分泌物对生境内地被层草本植物的影响。云杉幼树根系输入的分泌物对林下草本植物种子萌发和幼苗生长均具有抑制作用。在我国广泛分布的落叶乔木核桃(Juglans regia)根系分泌物也能明显抑制草本植物的种子萌发和幼苗生长(崔翠等，2013)。目前有关植物根系分泌物输入对林下植被生物多样性影响的调控机制并不十分清楚，但根系分泌物中的化感物质成分可能是造成根系分泌物产生抑制作用的重要原因(孙婧珏等，2013；Bertin et al., 2003)。根系分泌物是土壤环境中化感物质的主要来源(王延平等，2010)，很多植物根系均能够分泌化感物质，且化感物质的合成、分泌随着根系分泌物总量的增加而增加(孙婧珏等，2013)。化感物质在群落演替、植被恢复以及林业生产中也发挥重要的作用(张茂新等，2002)。因此，笔者推测森林根系能够通过根系分泌物的调控作用进而影响林下植物的生长。而人工林作为群落结构相对单一的森林类型，物种之间竞争更加激烈。植物个体为了适应快速生长的需求将分泌更多的化感物质，以抑制其他物种的生长和生存，这也是物种在长期进化过程中所形成的一种生存策略(陈龙池等，2003)。根系分泌物化感物质主要包括酚酸类、黄酮类等(吴林坤等，2014)，其中，酚酸类物质被认为具有较强的化感活性，且能对植物根系本身、根际微生物及根系周围生物生长和活性产生明显的抑制作用(Wu et al., 2001；谢星光等，2014)。本研究通过UPLC-MS检测后发现根系分泌物中存在多种酚酸类物质，产生抑制效应的原因是能够抑制种子萌发和幼苗生长所需的关键酶类，而多种酚酸同时存在时往往会产生更大的抑制作用(谢星光等，2014)。根系持续分泌势必会造成化感物质的积累，化感效应将逐步加强的剂量效应(李光等，2017)。

本研究仅对所获得的根系分泌物化感物质的酚酸类成分进行了定性检测，而未进行定量分析。同时，试验尚未进行多个根系分泌物浓度梯度的验证，在不同浓度情况下，根系分泌物对林下草本植物种子萌发和幼苗生长等生理生化活动的具体影响可能有所差异。因此，研究结果外推到森林生态系统尺度时，还需要进一步深入开展西南亚高山人工林根系分泌物输入对林下草本植物定居与更新影响的长期野外原位研究，以丰富对人工云杉林林下生物多样性形成机制的认识，并为我国大面积的人工林可持续管理提供有效的科学依据。

4 结论

1) 云杉幼树根系分泌物能够抑制林下草本植物种子萌发和幼苗生长。2)根系分泌物中存在的多种酚酸类物质可能是云杉幼树根系分泌物产生抑制作用的内在驱动机制。