针叶是松属(Pinus)树种进行光合作用、呼吸作用和蒸腾作用的主要器官，完成能量合成与代谢的主要场所。针叶形态的多样性可反应出遗传的多样性，也是了解植物遗传变异的重要线索(徐杨等，2016)。松属树种在种子萌发后，随着子叶的伸长，从上胚轴生长点萌发的幼茎上逐渐长出初生的条形叶，再从初生条形叶的叶腋长出次生针形叶，待次生针形叶完全成型时初生条形叶枯萎凋落。初生叶较纤细，单枚着生在幼茎上，次生叶2~3枚1束着生于初生条形叶的叶腋处。在外观形态上，次生叶具有更大的体积和表面积，叶面积是衡量叶片光合能力大小的重要指标之一，增大叶面积能提高光合能力，使植物在较短时间内快速生长(丁曼等，2014)。卢振元等(1980)研究表明认为红松(Pinus koraiensis)幼苗，幼苗新梢春季生长至冬季休眠的过程中，外界条件并不是苗木生长需求的主导因素，而是由苗木本身生长周期所决定，从生长锥产生的侧生器官的原基，通常不能在当年伸长，需要经过一个休眠期，新梢的生长是越冬芽中已有的侧生器官的原基伸长。华山松(P. armandii)、北美乔松(P. strobusi)等松属树种冬芽的萌发至新梢、针叶生长均有此类现象(李桂芬等，1990；张云跃等，1991)。欧洲赤松(P. sylvestris)幼苗的针叶原基通常处于休眠期，冬季进入深休眠状态，到次年春季解除休眠快速生长出次生叶，而部分幼苗能够在进入冬季之前通过环境因子(如温度、日照长短等)诱发针叶原基生长，在当年的秋季萌发出次生叶(Ekberg et al., 1979；Avia et al., 2015)。董伊晨等(2017)研究红松不同苗龄幼苗叶片性状发现，叶片在响应环境变化时会调整分配策略以维持植物体内同化作用和异化作用的平衡，确保幼苗稳定生长。

马尾松(P. massoniana)是我国分布较广泛的乡土造林树种，具有适应性强、生长快、生产力高等特点，为我国南方最主要的经济树种之一(丁贵杰等，2006)。马尾松成苗期初生叶存在的时间与次生叶出现的时间在种源间和个体间均存在着显著差异(俞新妥，1959；秦国峰等，2002)。在马尾松种源苗期试验中，马尾松成苗出圃造林时，会出现全初生条形叶、全次生针形叶以及中间型(既有初生叶又有次生叶)3种不同针叶类型幼苗，不同种源之间及同一种源内部都有此类现象发生(秦国峰等，2012)。目前关于马尾松幼苗的研究主要集中在种源、家系、无性系等遗传背景下，育苗基质、水肥配比、苗木菌根化等培育措施条件对幼苗养分利用、生理变化等方面(周志春等，2005；王剑等，2007；李莹等，2014)，关于初生叶和次生叶在表型特征、光合生理上的差异，是否会对幼苗的生长发育产生影响，进而是否影响到苗木质量，尚缺乏系统的研究。本研究以马尾松不同叶型幼苗为材料，分析不同叶型幼苗在生长、叶绿素荧光参数上表现出来的差异，结合苗木质量指数及造林1年后净生长量，研究叶型对马尾松幼苗光合生理及生长的影响，以期为马尾松优良种苗培育提供参考，为造林区不同立地条件下马尾松苗木的选择提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 供试材料与试验设计

供试材料来源于贵州省都匀市马鞍山林场国家马尾松良种基地(26°169′-26°170′N，107°623′-107°624′E)，海拔920 m左右，为中亚热带湿润气候，年均温15.8 ℃，年平均降水量约1 400 mm。采用良种基地内1.5代种子园种子进行容器育苗，基质为马尾松林地表土，2015年3月底开始播种育苗，育苗及管理按常规方法进行(周政贤，2001)，育苗工作在良种基地的苗圃完成。2016年2月底，随机选择长势良好、无病害的3种叶型马尾松1年生幼苗用于试验。其中，全初生条形叶幼苗记为类型Ⅰ，全次生针形叶幼苗记为类型Ⅲ，中间型幼苗记为类型Ⅱ。每种叶型幼苗各随机选取40株，去营养袋盆栽至贵州大学苗圃，土质选用适合马尾松生长的黄壤土并按叶型挂定标签。每隔3~4天浇水1次，缓苗1个月后，进行相关指标测定。

2016年2月底，随机选取长势良好、无病害的3种叶型幼苗进行造林试验。造林地位于距良种基地30 km的贵州省都匀市坝固乡，该地区以山地为主，海拔1 000 m左右，土壤主要以山地黄壤土为主。按随机完全区组进行设置，3次重复，株行距为2 m×3 m，每个小区60株，块状小区，每小区6行10列，重复(区组)的方向垂直于坡位方向。2017年1月，进行每株检尺，测定苗高及地径，并统计每种类型幼苗造林成活率。

1.2 试验方法

1) 初生叶与次生叶形态指标测定

于2016年3月底，采用WinSEEDLE种子和针叶图像分析系统对初生叶与次生叶形态指标进行测定，类型Ⅰ与类型Ⅲ幼苗各随机选取200片长势良好的功能叶测定叶长、叶宽、叶表面积和叶片体积等形态指标。

2)光合色素含量测定  于2016年3月底，分别采集全初生叶形和全次生叶形幼苗中上部的功能叶，迅速装入自封袋中，放入冰盒带回实验室。采用丙酮浸提法进行光合色素含量的测定(Sükran et al., 1998)，每个样品重复4次。按下列公式计算：

$ \begin{array}{l} 叶绿素\;{\rm{a}}\left({{\rm{Chlorophyll}}\;{\rm{a}}} \right) = 11.75{{\rm{A}}_{662}} - 2.35{{\rm{A}}_{645}}；\\ 叶绿素\;{\rm{b}}\left({{\rm{Chlorophyll}}\;{\rm{b}}} \right) = 18.61{{\rm{A}}_{645}} - 3.96{{\rm{A}}_{662}}；\\ 类胡萝卜素\left({{\rm{Carotene}}} \right) = 1000{{\rm{A}}_{470}} - 2.27{\rm{Chla}} - 81.4{\rm{Chlb/227；}}\\ {\rm{叶绿 素总量}}\left({{\rm{Chlorophyll}}} \right) = {\rm{Chlorophyll}}\left({{\rm{a + b}}} \right)。\end{array} $

3) 叶绿素荧光动力学参数测定  于2016年3月底，采用便携式荧光仪(Junior-PAM)对幼苗进行叶绿素荧光参数测定，随机选取类型Ⅰ与类型Ⅲ幼苗各6株，每株重复3次。叶片暗适应40 min后，先进行慢速诱导动力学曲线测定，照射测量光(小于0.5 μmol·m^-2s^-1)测定初始荧光值(F_o)，给以0.6 s的饱和脉冲(约10 000 μmol·m^-2s^-1)测定最大荧光值(F_m)。根据F_o和F_m计算出可变荧光F_v(F_v=F_m-F_o)、PSⅡ最大光化学效率(F_v/F_m)、PSⅡ潜在光化学效率(F_v/F_o)。

根据Inoue等的方法进行快速光响应曲线(RLCs)参数测定(Inoue et al., 2004)，设置0~1 500 μmol·m^-2s^-1共11个梯度的光化光强度。PSⅡ的实际光合量子产量[Y(Ⅱ)]、光化学淬灭系数(q_P)、非光化学淬灭系数(NPQ)、PSⅡ调节性能量耗散Y(NPQ)、非调节性能量耗散Y(NO)、相对电子传递速率(ETR)等参数数值由仪器直接读取，有效光合量子产量(F_v′/F_m′)由计算可得。在程序自动拟合快速光响应曲线后，可得到快速光曲线的初始斜率(α)、光抑制参数(β)、最大电子传递速率(ETR_max)，半饱和光强(I_k)。

4) 生物量测定  于叶绿素荧光参数测定完成后进行。3种类型幼苗各随机选取6株，每株样品称量鲜质量(g)后将植株分为根、茎、叶，分别放入牛皮纸信封后置于烘箱内，105 ℃杀青30 min，75 ℃烘干至恒质量后，分别称量根、茎、叶干质量(g)。

5) 苗木质量指数  苗木质量指数(QI)=苗木总干质量(g)/{[苗高(cm)/地径(mm)]+[茎干质量(g)/根干质量(g)]}。

1.3 数据分析

各处理间的差异性分析采用SPSS 20.0软件中的One-way ANOVA和SNK法多重比较及配对样品T检测法，置信区间默认为95%。

2 结果与分析 2.1 马尾松不同叶型幼苗生长量的差异

由表 1可知，出圃时，3种类型幼苗苗高、地径间存在显著差异。类型Ⅱ与类型Ⅲ之间地径、生物量和苗木质量指数(QI)等指标差异不显著，但均显著的高于类型Ⅰ，其中生物量分别是类型Ⅰ的1.56、1.73倍；类型Ⅰ、Ⅱ幼苗苗高显著高于类型Ⅲ。3种针叶类型幼苗根、茎、叶生物量的分配规律表现出一定的相似性(图 1)，单株内生物量分配表现为叶>茎>根，其中类型Ⅰ幼苗根部干物质积累所占比例较高，达到整株干质量的20.51%；类型Ⅱ幼苗叶部干物质积累所占比例达整株干质量的47.89%；类型Ⅲ幼苗茎部干物质积累占整株干质量的38.46%，略高于其他2种类型幼苗。类型Ⅱ、Ⅲ幼苗的苗木质量指数(QI)显著的高于类型Ⅰ、Ⅱ，表明在出圃时，有次生叶的幼苗苗木综合表现较好。

3种类型苗木的造林成活率均在90%以上(表 1)，其中类型Ⅲ苗木的造林成活率最高。造林1年后，3种类型苗木的地径生长明显，净增长量1.01~1.02倍。在苗高生长方面，类型Ⅲ苗木的苗高增长量最大，为2.26倍；类型Ⅱ苗木次之，为2.15倍；类型Ⅰ苗木的苗高生长量仅为1.90倍，表明类型Ⅲ苗木在造林1年后的生长表现最好。

2.2 初生叶与次生叶形态特征差异

通过对初生叶和次生叶形态指标测量分析可知(表 2)，2种叶型叶长、叶表面积、叶体积及比叶面积存在显著差异(P < 0.05)，叶宽差异不显著。其中，次生叶的叶长、叶表面积、叶体积和比叶面积较初生叶分别增大了135.53%、158.64%、165.22%和37.62%，表明次生叶可获得较多的光合作用面积。

2.3 马尾松幼苗初生叶和次生叶光合色素含量的差异

由图 2可知，初生叶的光合色素含量(除类胡萝卜素)均显著或极显著的高于次生叶。与次生叶相比，初生叶的叶绿素a和叶绿素b含量分别高28.57%和97.03%，总叶绿素高41.59%。2种叶型的类胡萝卜素含量趋于一致，差异不显著。

2.4 马尾松幼苗初生叶与次生叶的叶绿素荧光参数

1) 2种叶型F_o、F_m、F_v/F_m与F_v/F_o的比较由表 3可知，2种叶型的初始荧光F_o趋于一致，差异不明显；对于最大荧光F_m，初生叶显著大于次生叶，前者比后者高12.21%；PSⅡ反应中心原初光化学效率F_v/F_m和PSⅡ潜在活性F_v/F_o，初生叶均显著高于次生叶。这表明与次生叶相比，初生叶拥有较高的将光能转化成化学能的潜在能力。

2) 2种叶型PSⅡ反应中心参数变化比较  由图 3可见，PSⅡ反应中心实际光合量子产量Y(Ⅱ)表示实际光能转化效率，该值的大小反映PSⅡ活性强弱；有效光合量子产量F_v′/F_m′表示开放状态下PSⅡ最大原初光能捕获效率。2种叶型Y(Ⅱ)和F_v′/F_m′均随着PAR增强而降低，两者下降幅度趋于一致，但整个光响应过程中初生叶Y(Ⅱ)和F_v′/F_m′值均大于次生叶。其中，在0~1 500 μmol·m^-2s^-1范围内初生叶的Y(Ⅱ)变化值为0.546~0.142，次生叶为0.445~0.084；F_v′/F_m′变化值分别为0.566~0.461和0.449~0.378。表明初生叶有效光量子产量较多，光能利用率较高。

3) 2种叶型光化学淬灭(q_P)和非光化学淬灭(NPQ)比较  由图 4可见，2种叶型的q_P随着PAR的增加而减小，初生叶q_P值始终高于次生叶，在0~845 μmol·m^-2s^-1内，两者q_P差值呈增加趋势，最大差值为0.112，当PAR>845 μmol·m^-2s^-1后，初生叶和次生叶q_P差值逐渐稳定。NPQ变化与q_P变化相反，随着PAR的增加而呈现升高的趋势，当PAR < 550 μmol·m^-2s^-1时，次生叶NPQ值明显高于初生叶，随着PAR增加次生叶NPQ值增幅逐渐变小，而初生叶NPQ迅速上升并逐渐超越次生叶。这表明在强光照下，2种叶型发生淬灭方式主要表现为反映热耗散能力大小的非光化学淬灭。

4) 2种叶型PSⅡ调节性和非调节性能量耗散参数对光强的响应  由图 5可见，2种叶型Y(NPQ)值随PAR的增加而呈现逐渐升高的趋势，其中0~700 μmol·m^-2s^-1范围内，次生叶Y(NPQ)值明显高于初生叶；当PAR>420 μmol·m^-2s^-1后，初生叶Y(NPQ)值急速升高，而次生叶增速变缓，最终初生叶Y(NPQ)显著高于次生叶。2种叶型Y(NO)值随光强的增加均呈现先升高后降低的变化，并逐渐趋于稳定，整个光响应过程中，次生叶Y(NO)值始终显著高于初生叶。这表明初生叶在应对强光照时，以提高调节性能量耗散为主。

5) 2种叶型电子传递速率(ETR)的光响应  ETR表示实际光强下通过PSⅡ的表现电子传递速率。由图 6可知，2种叶型的ETR值随光合有效辐射的增加而增大，其中初生叶的ETR值及增幅均显著大于次生叶，光响应过程中次生叶ETR增加逐渐变缓，趋于稳定。这表明初生叶ETR饱和点高于次生叶，耐光抑制能力较强。

6) 2种叶型光响应曲线拟合参数比较  通过对光响应曲线的拟合，得到最大电子传递速率(ETR_max)、初始斜率α、光抑制参数β和半饱和光强(I_k)。初生叶的ETR_max和I_k值均显著高于次生叶，前者分别是后者的1.95和1.57倍；初生叶初始斜率α较大，表明其光化学反应启动较快；次生叶的光抑制参数β显著小于初生叶，表明其耐光抑制的能力较弱。

3 讨论

苗木质量不仅能反映苗木的内在品质、生存潜力及活力，还决定着造林后的成活率(李国雷等，2012)。苗高和地径是苗木质量评价中应用最广泛的形态指标，而苗木质量指数能够直接反映出苗木品质的优劣以及其对生存微环境的适应性(江赢等，2014)。本研究发现，出圃时虽然3种叶型幼苗平均地径相差不大，但平均苗高较低的全次生叶幼苗却拥有最高的生物积累量，苗木质量指数也显著高于其他类型幼苗，结合造林1年后检尺及成活率数据，表明造林初期全次生叶幼苗缓苗期较短，苗高、地径净生长量和成活率均高于全初生叶和中间型幼苗，显示出较高的生长优势，这可能与幼苗自身适应能力及立地条件、环境影响有关，笔者课题组在研究马尾松不同叶型幼苗应对持续干旱胁迫及复水处理时发现，不同叶型幼苗表现出不同的响应调节能力(王好运等，2018)。本研究还发现，马尾松3种叶型幼苗各部分生物量分配规律相似，干物质多积累在叶片，其次是茎，最少的是根部，这与杨其光(1981)研究结果一致。以单株干质量而言，全次生叶幼苗叶片干物质积累量最多，有研究表明次生叶叶长、叶宽、体积和表面积等形态指标均显著大于初生叶(周政贤，2001)，本研究也得到相同的结果，马尾松幼苗次生叶与初生叶相比，叶长、叶表面积和叶体积均显著增大，表明在马尾松苗期发育过程中，通过增大叶片形态结构来获得更多的光能。且次生针叶两针一束着生于茎枝，初生叶单枚着生，因此具次生针叶的幼苗叶的数量也更多。总体来看，具有次生叶的幼苗，总的光合作用面积更大。

光合色素对光能具有吸收、传递和转化的功能。蒙古栎(Quercus mongolica)叶片中叶绿素含量与光合速率呈显著正相关(崔西甜等，2017)。有关水稻(Oryza sative)低叶绿素含量突变体光合作用的研究显示，突变体的产量与对照无显著差异，高叶绿素含量并不是叶片高光合速率的必要条件，而叶绿素含量适宜的品种更有利于叶片内氮素在其他光合器官中的分配(顾骏飞等，2016)。本研究中，初生叶中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著高于次生叶，但由于初生叶的形态结构较小，导致整体获得用于光合作用的光能较少，最终，具有次生针叶幼苗干物质的积累显著高于初生叶幼苗。而类胡萝卜素主要行使光能捕获和光破坏防御2个功能，在研究中初生叶和次生叶中类胡萝卜素含量并没有显著差异，表明2种叶型的光能捕获和光破坏防御能力相似。

叶绿素荧光参数是反映植物光合性能的重要指标，可以从光能的吸收、传递耗散和分配等方面了解植物的生长状况(李超等，2012)。通常叶片吸收的光能一部分用来驱动光化学反应，多余的能量以热的形式耗散(杨娟等，2014)。叶片热能量耗散是叶片功能性状之一，当遇到较强的光照辐射时，植物能够将剩余的光能通过热耗散的方式释放出去，从而达到保护光系统结构的目的，如通过叶黄素循环、PsbS蛋白和跨类囊体膜的质子浓度等(Scoffoni et al., 2011；Ogburn et al., 2012)。有研究表明，比叶面积与叶片热能量耗散存在一定的相关性，植物通过选择小而厚的叶片，形成尽可能小的比叶面积，将更多的干物质用于保卫组织的构建，从而促进叶片对过剩能量的热耗散(李群等，2017)；较低的比叶面积具有较高的热交换能力(李玉霖等，2005)。本研究发现，较小比叶面积的初生叶在强光照下形成了较高的非光化学淬灭参数NPQ，表现出较高的热耗散能力，与上述研究结论一致。q_P为光化学淬灭系数，表示PSⅡ天线色素吸收光能用于光化学电子传递的比值，反映PSⅡ的电子传递活性和光能利用率(曹军胜等，2006)。随着PAR的递增，2种叶型的q_P呈现相似且稳定的下降趋势，表明由光合作用引起的光化学荧光淬灭并未因光照的增强而发生急剧的改变。NPQ为非光化学淬灭参数，其多用来反映植物热耗散的能力(涂志华等，2012)。在低光强下，初生叶的NPQ较小，随着PAR持续增加，其NPQ增加速率明显大于次生叶，最终显著高于次生叶。这表明低光强下，初生叶用于热耗散的光能较少，光化学电子传递量较多，从而维持较高的光能转化效率，而在高光强下，初生叶可以提高热耗散能力来保护光系统结构免遭破坏。

F_o是当PSⅡ反应中心都处于开放状态时的最小荧光产量，其对光合作用的光化学反应并没有影响(沈燕等，2013)；F_m表示PSⅡ反应中心所有电子门关闭时的最大荧光量，可以反映通过PSⅡ的电子传递情况(吴甘霖等，2010)。在本研究中，2种叶型的初始荧光值没有表现出显著差异，而初生叶F_m值却显著高于次生叶，表明当PSⅡ反应中心处于关闭状态时初生叶拥有较高的电子传递量。F_v/F_m和F_v/F_o分别表示PSⅡ反应中心光合原初反应能量转化效率和光化学反应情况，其中F_v/F_m升高或降低是反映光抑制程度的良好指标(张守仁等，1999；何炎红等，2005)，F_v/F_o常用于度量PSⅡ潜在光合活性(向芬等，2014)。F_v/F_m代表PSⅡ最大光化学效率，反映了光抑制能力，适宜条件下植物叶片一般在0.75~0.85之间(Granda et al., 2014)，由于不同生境适应性的影响，F_v/F_m值可能会略有偏差(李磊等，2011)。马尾松幼苗初生叶的F_v/F_m和F_v/F_o均显著大于次生叶，表明初生叶PSⅡ原初光化学效率和能量传递效率高于次生叶，PSⅡ潜在活性较强。

实际光合量子产量Y(Ⅱ)和有效光化学量子产量F_v′/F_m′反映叶片光下的实际光能转化效率(黄敏参等，2012)。ETR代表在实际光强照射下通过PSⅡ的相对电子传递效率(徐德聪等，2007)。本研究发现，初生叶的Y(Ⅱ)和F_v′/F_m′在不同光照强度下均显著高于次生叶，随着PAR增强其ETR与次生叶的差距明显逐渐增大。PSⅡ反应中心吸收的光能除了分配于Y(Ⅱ)，还有调节性能量耗散Y (NPQ)和非调节性能量耗散Y(NO)(Kramer et al., 2004)。本研究发现，在模拟快速光响应曲线过程中，随着PAR的增加，2种叶型的Y(Ⅱ)不断减小，Y(NPQ)逐渐增加，Y(NO)先小幅上升后略下降最后基本保持稳定，这说明在强光照下，马尾松幼苗是通过调节Y(NPQ)来减少过量光能对光系统结构的损害，这与银芽柳(Salix leucopithecia)(钱永强等，2011)、白榆(Ulmus pumila)(韩炜等，2010)的能量分配相似。而初生叶与次生叶相比，随着PAR的增加，Y(NPQ)一直保持快速增长，当PAR>845 μmol·m^-2s^-1后，初生叶的Y(NPQ)超过次生叶，表明随着光强的增加，初生叶的热耗散响应方式以调节性能量耗散为主。初生叶最大电子传递速率(ETR_max)、光能利用效率(α)、光抑制参数(β)和光耐受能力(I_k)均显著高于次生叶，表明在强光生境下，初生叶类型幼苗会通过提高电子传递速率来响应能量过多耗散带来的影响。

4 结论

与次生叶相比，马尾松初生叶具有较高的叶绿素含量，较耐光抑制，有较高的光能转化效率，在高光强条件下，能够迅速启动高能态淬灭机制以热耗散的形式来减少光能对光合系统的损害，通过增加电子传递速率，使整个光系统形成一套稳定的光合色素-蛋白淬灭复合物来耗散过剩光能的耗散程序。次生叶由于其叶长、体积和表面积等形态指标均显著大于初生叶，能够获得较多的光照进行光合作用，有利于植株整体的光合，因而具有次生叶的幼苗，干物质的量积累更多，出圃时的苗木质量以及造林后的生长表现均高于全初生叶的幼苗。