枣树(Ziziphus jujuba)原产于我国，至今已有3 000余年的栽培历史。枣树具有抗逆性强、适生区广、农事操作简便、果实营养丰富、经济用途多等优点，为我国农民致富、出口创汇、国民营养保健和生态环境建设做出了巨大贡献。然而由植原体(Candidatus Phytoplasma)引起的枣疯病严重威胁枣树的健康、产量和生产。被该病原菌感染的枣树表现为腋芽萌发、节间缩短、小叶、枝条丛生、黄化、花变叶等症状，发病枝不能正常结枣或结出畸形病果，患病枣树生长逐渐衰退，多在几年内枯死，再加上该病能够通过媒介昆虫传播，传染性极强，已经成为我国枣树生产上毁灭性的生物灾害(刘孟军等，2010)。

北京市作为一个古都，枣树栽植历史悠久，市区内分布着大量百年以上树龄的古枣树。同时北京也曾是枣的传统生产区，例如密云区曾是金丝小枣(Z. jujuba cv. Jinsixiaozao)的主产区，怀柔、昌平、丰台等区现在仍种植着大量的枣树(田国忠等，2013)。随着都市建设、林业生态环境的变化，枣疯病在北京大量发生并有加重的趋势，严重威胁到北京枣产业的健康发展，并危及有重要历史文化和园林价值的古枣树的保护。近年来在对北京市区枣疯病发生和危害的调研中发现，一些古枣树单株在周围存在枣疯病树的环境中健壮生长，并没有遭受枣疯病的侵害。因而推测可能是这些历经朝代更替的古枣树来源较广，存在着较高的遗传多样性，加之受枣疯病常年的危害以及自然或人为的选择，可能保存了对枣疯病有不同抗性的种质资源。因此，本研究从2011年开始对北京市区枣树种源进行了调查，翌年开始从未发病枣树(大部分为北京市挂牌保护古树)上采集接穗，嫁接到北京郊区发病的枣树砧木上，通过观察嫁接传病接穗的发病情况和病原检测，鉴定不同单株来源的接穗材料的抗病能力。经过连续2年(2012—2013)的筛选和重复测定，初步了解了现存的部分分布在城区的古枣树对枣疯病的遗传抗性状况，筛选出了具有潜在开发利用价值的抗病品系。

1 材料与方法 1.1 接穗的采集

2012年3月，在北京市区公园、街道和胡同内健康的古枣树上开始采集接穗。共从147株古枣树上采集，每株采集20~30个接穗作为重复，接穗长度约为5~6 cm。对不同株系采集的接穗马上进行蜡封，依次编号(1~147)登记，置低温下冷藏保存备用。从中国林业科学研究院枣树资源圃采集已鉴定抗性的枣树品系作为对照，包括高抗品系(high resistant，HR)骏枣(Z. jujuba cv. Junzao)T27，中抗品系(resistant，R)交城甜酸枣(Z. jujuba cv. Jiaochengtiansuanzao)T31、洪赵小枣(Z. jujuba cv. Hongzhaoxiaozao)T30和蜂蜜罐(Z. jujuba cv. Fengmiguan)M11；另有河北农业大学刘孟军教授提供的高抗品种‘星光’(Z. jujuba cv. Xingguang)XG，河北省涿鹿县林业局提供的普抗(或中抗)品系(middle resistant，MR)悠悠枣(Z. jujuba cv. Youyouzao)W10，河南省濮阳市林业科学研究院李志清研究员提供的高感病品系(highly susceptible，HS)冬枣(Z. jujuba cv. Dongzao)L2作为对照。

1.2 砧木的选择与嫁接

2012年嫁接地点选择在北京市怀柔区桥梓乡红林村低山坡地栽植的枣园中，砧木品种为尜尜枣(Z. jujuba cv. Gagazao)，树龄为10年左右，嫁接部位的砧木枝条发病病级在Ⅳ—Ⅴ级。2013年复选实验地点选在北京市昌平区流村镇北流村的枣园中，枣园为平地，砧木为枣疯病发生严重的(病级Ⅳ—Ⅴ级)冬枣品种。

嫁接时间均在4月底至5月初，2012年怀柔区嫁接的为北京市区古枣树上采集的147种接穗，对照品系为中国林科院采集的T27、T31、T30和T19。2013年在昌平区进行复选鉴定试验，嫁接的为2012年初筛出来的46个抗性单株上重新采集的古枣树株系接穗，以及对照品系为T27、T31、T30、M11、XG、W10和L2。嫁接方式为将发病级别在4级以上的病枝从主干中部截断，在截口处通过插皮接或贴接方式嫁接待鉴定的接穗，塑料条带绑缚，定期观察接穗被感染和发病程度。不同地点或不同嫁接时间的重复嫁接次数为2~3次(个别单次嫁接除外)，使每一待测株(品)系嫁接接穗总数在20个左右，部分达30个以上，嫁接部位分别选取砧木病树的上中下位置。

1.3 发病级别与生长状况调查

6—10月每隔30日左右调查1次嫁接接穗发病情况(发病率和病情指数)和接穗生长状况(包括总枝长和最长枣吊长度)。嫁接第2年的7、10月追踪调查接穗存活、发病和恢复正常生长以及结果情况。

接穗发病级别分为6级：0级，无明显症状；Ⅰ级，新发枝花梗明显延长，或顶梢叶变小、颜色变浅绿，小叶比率低于整枝的10%；Ⅱ级，新梢小叶，节间缩短，腋芽明显伸长或花变叶比率在11%~20%之间；Ⅲ级，丛枝小叶比率达21%~50%；Ⅳ级，丛枝小叶比率达51%~90%；Ⅴ级，丛枝小叶比率达91%~100%(刘孟军等，2010；田国忠等，2013；任争光等，2015)。病情指数计算公式如下：

病情指数={[∑(病级×该病级接穗数)]/(调查总接穗数×最高病级)}×100。

1.4 植原体检测方法 1.4.1 样品采集

田间采集待测接穗枝叶，装入塑料袋，带回实验室，4 ℃低温冷藏或-20 ℃冰冻保存备用。

1.4.2 样品总DNA的提取

取适量枣树树皮、叶柄或叶脉等含韧皮部组织的样品，用液氮研磨成粉末状，称取0.1 g粉末于2 mL离心管中，用植物基因组DNA快速提取试剂盒(北京博迈德生物技术有限公司)提取样品总DNA，将枣树样品总DNA置于-20 ℃保存备用。

1.4.3 直接PCR和巢式PCR

以上述样品总DNA为模板，利用植原体16S rDNA基因保守序列引物R16mF2/R2(R16mF2: 5′-CAT GCA AGT CGA ACG GA-3′；R16mR2: 5′-CTT AAC CCC AAT CAT CGA-3′)和R16F2n/R2(R16F2n: 5′-ACG ACT GCT AAG ACT GG-3′；R16R2: 5′-TGA CGG GCG GTG ACA AAC CCC G-3′)进行直接PCR和巢氏PCR。直接PCR反应体系30 μL：包括15 μL 2×Taq MasterMix，12 μL ddH₂O，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性5 min；35个循环：95 ℃ 35 s，52 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min 30 s；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。巢氏PCR利用直接PCR产物40倍稀释液做为DNA模板，PCR扩增体系和反应条件与直接PCR相同。最后PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并利用凝胶成像系统观察拍照。

1.5 数据统计分析

用Excel软件对各品系接穗发病率和病情指数及生长情况进行统计分析，包括分布频率、月度变化和正态分布分析等。用SPSS19.0软件的欧氏距离与类平均法对接穗的抗病能力进行聚类分析，聚类分析的依据为各株系接穗不同月份病情指数。

2 结果与分析 2.1 不同品系接穗嫁接后发病情况

2012年5月上旬对采集的147种接穗进行嫁接，分别在嫁接1个月(6月1日)，2个月(7月2日)，3个月(8月7日)，4个月(9月12日)和5个月(10月10日)时对各接穗的发病情况进行调查，对接穗的总体发病率和病情指数(当月所有种类接穗的平均值)进行统计分析。结果发现(图 1)，各接穗嫁接后的总体发病率和病情指数均随嫁接接种时间而出现升高的趋势。在嫁接接种后30天(6月1日)接穗总体发病率和病情指数均较低，而嫁接接种60天左右(7月2日)发病率迅速升高至70%左右，说明7月是嫁接传病成功后的发病关键期，而进入8—10月，平均发病率稳定在80%~90%之间。病情指数与发病率的变化稍有不同，即在整个嫁接后的生长期内一直处于不断上升期，进入10月达到最高值，说明各接穗发病严重度总体存在逐渐累加的现象。但病情指数最明显的增长期也与发病率变化过程一致，即在6—8月之间。综合以上结果可以得出利用该嫁接方法进行接种传病和诱导发病的效果是理想和客观的。嫁接后期(9—10月)的发病率和病情指数均相对稳定，一方面反映了嫁接后4个月内，接穗在遗传上的抗病或感病性都得到了充分的表现，另一方面也与待鉴定接穗中存在一定比率的抗病性种质资源以及这些抗病品系的抗性表现稳定有关。

2.2 嫁接后不同接穗的症状分化

对2012年嫁接的接穗症状的调查发现，不同单株上采集的接穗嫁接后症状表现出明显分化，发病级别从0级的不发病，到严重的Ⅴ级都有分布。大部分接穗都能先后表现出枣疯病症状：花梗延长、花变叶、小叶和丛枝。最后鉴定为感病品系的症状出现早、发病级别高；抗病品系发病时间延迟，病枝的发病级别低或不发病。一般情况下，当年发病级别高的接穗(Ⅳ—Ⅴ级)秋季不能正常落叶，在冬季整个接穗多被冻死，发病级别低(Ⅰ—Ⅲ级)的接穗能正常落叶，枝条次年发病会加重。有一些品系的接穗，在嫁接发病前期已表现出典型的丛枝症状，但在当年生长后期丛枝症状减轻或消失，比如高抗品系T27及接穗40、117、104、100、103、105号等。也有一些品系接穗嫁接的当年发病枝，次年逐渐转化为正常枝，并能正常开花结果，比如11号等。在嫁接发病后恢复正常的抗病品系上有的能结出正常的枣果，但也出现典型的病果，这些病果多为畸形果(果面不平、颜色发青，干缩)，果实水分少、甜度降低或味苦。

2012年来源于不同单株的接穗嫁接接种后不同月份的病情指数分析结果(图 2)也表明，被感染的接穗数目和病害严重程度呈不断加重的趋势。其中嫁接接种1个月时(6月1日)未表现症状的接穗比率最大，7月不同病情指数接穗分布最为广泛，症状分化情况也最为显著，而至8月以后接穗的分布逐渐向高病情指数区域靠拢，并在9月和10月达到最高值。正态分析结果显示除6月和7月频数分布为正偏态(右偏态)分布外，其余月份包括2012年5个月的总体平均值均为负偏态(左偏态)分布，这说明待测接穗多数为感病品系，但仍有一定的抗病品系存在。以2012年5个月的病情指数总体平均组为依据，挑选出平均病情指数低于60的接穗作为界限，共初筛出45种抗病株系在2013年进行嫁接接种复选。

2.3 初筛抗病接穗在2013年复选中的表现

重新采集初步筛选出的45个品系接穗和对照高抗品系XG和T27，抗病品系T30、T31、M11和W10，以及感病品系L2接穗，于2013年5月上旬嫁接在北京昌平区的重疯枣园内的发病砧木上，嫁接后每隔30天左右调查发病情况。结果发现与2012年的测定相比，2013年复选的52个接穗(包括对照)的不同月份病情指数变化趋势有所不同，呈现为温和的累加过程(图 3)。大部分接穗病情指数分布停留在60以内的区域，6—10月以及总体平均值分布均为正偏态(右偏态)分布(图 3)。这种现象应与所测定的接穗主要是候选的抗病材料有关，也反映出所选材料的抗病稳定性及怀柔和昌平两地测定结果的良好的重复性和一致性。

2.4 复筛品系接穗抗性类型聚类分析结果

以2013年复筛接穗6个月的病情指数为变量，对35个待测品系(去除了数据不完整的接穗号)和7个对照品系接穗的抗性种类进行了聚类分析，结果显示(图 4)，当组间的联结距离大于16时，这些接穗共分为2大类群。类群Ⅰ为1、2、4、11和12等24种待测接穗以及对照高抗(HR)品系T27、XG，抗病品系(R)T30、T31和M11，该类群应为抗病品系类群。类群Ⅱ为27、45、103和138等11个待测接穗，以及对照普抗(MR)品系W10和高感(HS)品系L2，该类群抗病性较弱，应为普抗品系或感病品系。而当组间联结距离为10的水平时，类群Ⅰ又被分为2个大枝：即以高抗(HR)品系T27、XG为代表的高抗组群，这类接穗年平均病情指数均在30以内；以抗病(R)品系T30、T31为代表的抗病组群，这类接穗年平均病情指数在30~60之间。类群Ⅱ中高感(HS)品系L2单独分离出来(年平均病情指数﹥80)，其他接穗和普抗(MR)品系W10聚在一起(60 < 年平均病情指数 < 80)。

2.5 不同抗性接穗嫁接当年生长量

对2012年所有初步鉴定为抗病品系(年平均病情指数≤60)，感病品系(60 < 年平均病情指数≤80)和高感品系(年平均病情指数﹥80)接穗的枣枝和枣吊的年平均生长量进行调查和测量。结果显示(图 5)高感品系的平均生长量最小，枣枝和枣吊的平均生长量分别是24 cm和17 cm；感病品种居中，枣枝和枣吊的平均生长量分别是36 cm和18 cm；抗病品系的平均生长量最大，分别是57 cm和21cm。不同抗性品种间枣吊长度差异不大，枣枝长度差异较为明显，抗病性越好、发病程度越轻的品系生长量越大。

2.6 接穗中病原的PCR检测结果

在对嫁接接穗跟踪调查的同时，为了充分了解嫁接传病效率和不同接穗对病原侵染和繁殖的影响，对2012年怀柔嫁接接种后7、8、9和10月采集的接穗样品及部分砧木中植原体进行PCR检测。其中7月检测样品102份(包括所有发病级别样品)，8—10月分别检测45、50和35份(主要为发病在0—Ⅱ级的样品)。直接和巢氏PCR检测结果显示(表 1)，7月直接PCR对无症(0级)样品的植原体检出率只有5.9%，进一步的巢氏PCR检出率可达43.8%，巢氏检出率比直接PCR高6.4倍，说明嫁接接种2个月左右仍未表现症状的大部分样品此时已有近一半也感染了植原体、但浓度仍很低。而随着接穗病级的增加直接PCR和累计检出率也在增大，当检测样品发病级别在Ⅲ级及以上时直接PCR和累计检出率为100%，说明这类样品中的植原体浓度较高，也说明症状的发展和植原体浓度提高相关。从抗病反应明显的无症样品(0级)的持续检测结果来看，在7—10月的直接和巢式PCR的累计检出率分别为47%、63.2%、92%和35%(表 2)。呈现了由低到高、在9月到达高峰值而进入10月迅速下降的趋势。这个趋势也反映了接穗被植原体感染和繁殖活动的变化，即在7—9月接穗逐渐被感染或病原繁殖加速，进入10月份或因枣树抗性增强或因气温下降而导致植原体繁殖力下降。

2.7 7个优选抗病品系抗性稳定性、接穗生长和结果特性

2014年10月对2013年昌平区复选的材料中恢复正常生长并能结果的嫁接接穗进行了跟踪调查，优选出了7个抗病、丰产、具有直接和潜在开发利用价值的株系。从这7个品系的抗病能力和园艺学形状可以看出(表 3、图 6)，这几个株系皆表现出了对枣疯病较高且稳定的遗传抗性。除1#株系为椭圆果外，其余几个株系皆为纺锤形或马牙形、口感脆甜、鲜食性枣果株系。应该属于与尜尜枣、马牙枣(Z. jujuba cv. Mayazao)、悠悠枣(W10)亲缘关系最近的种类。虽然该系列的枣树都具有对枣疯病的一定抗性，但从本实验测定的抗病能力来看，这几个品系，特别是127和139#其抗病能力都显著高于对照品系W10，也高于同时测试的马牙枣、尜尜枣等品系(结果未显示)。所以这几个株系或者在直接栽培利用、作为嫁接繁殖材料，或者作为进一步的抗病育种材料方面都具有潜在的巨大利用价值。

3 讨论

本研究对枣树接穗体内病原的PCR检测结果表明，嫁接到发病的砧木上的抗病品系虽然未表现症状，但仍能用灵敏的巢式PCR检测到植原体的普遍感染，从而充分证明该嫁接传病方式和PCR检测技术的结合是确定接穗被有效感染和快速筛选高抗品系的良好方法。同时，某些抗病枣树体内应存在对病原生长和繁殖有明显抑制作用的物质。尤其在一些接穗嫁接接种早期也表现出典型的丛枝症状，体内的病原也易于被检测到，但随着抗病反应的激发、诱导和持续作用，抗病接穗的病症得到抑制或逆转乃至康复，体内的病原浓度也大大降低乃至检测不到，表明有抑菌或杀菌机制的存在。这种情况已在高抗品种“星光”XG和壶瓶枣(Z. jujuba cv. Hupingzao)抗病物质分析时被初步证实(温秀军等，2005；刘孟军等，2006)。本研究虽未发现对植原体绝对免疫的株系，但上述7个优选株系及其他抗病株系都具有嫁接传病当年接穗感染发病、后期或次年症状又能消失和病原浓度降低的特点，而且这些抗病接穗第3年(2015年)和第4年(2016年)的调查结果显示，除部分品系出现一定比例的病果外，多数品系能持续维持正常枝叶生长和结果(数据未显示)，进一步证明通过抗病接穗嫁接改造病株(园)、采用抗病砧木和用抗病接穗就地嫁接野生酸枣(Z. jujuba var. spinosa)等抗病品种利用途径在枣疯病防控上具有很大的应用潜力和前景(田国忠等，2009；刘孟军等，2010)。

枣树对植原体的抗性机制可能涉及枣树体内合成的抑菌物质，以及由病菌侵染诱导寄主产生的一系列抗病反应，比如过敏性坏死、氧化酶变化、过氧化氢产生、植保素、水杨酸或茉莉酸的抗病信号物质积累等(朱凤平等，1994；田国忠等，1994；2010；Musetti et al., 2010)。另外，在本次筛选中部分嫁接株系出现了叶片黄化和梢枯等现象，这可能与病原定殖部位韧皮部筛管的坏死、胼胝质过度积累、次生韧皮部形成等有关(田国忠等，1994；Kartte et al., 1988)。植原体能够产生小分子的效应子蛋白，这些效应蛋白能够通过调控寄主基因表达和代谢过程实现与寄主互作，产生对寄主的适应性、致病作用或诱导寄主的抗病反应等(Hoshi et al., 2009；Sugio et al., 2011；MacLean et al., 2014)。因而，抗病品系是否产生针对效应蛋白表达有抑制作用的物质是今后值得研究的课题。已鉴定的不同抗病反应类型的枣树品系，为下一步开展抗病与感病品系基因表达差异、抗病相关基因鉴定，以及阐明抗病机制都提供了丰富的材料和奠定了坚实的基础。本试验嫁接到发病砧木上最后能恢复正常生长和结果的枣树株系更是研究抗病机制的理想材料。

在2012年初选的接穗中有部分株系发病严重，病枝当年冬季即被冻死，这些株系被鉴定为感病株系，该鉴定结果对古树的枣疯病预防和枣树保护也具有重要指导意义。而另一部分抗病接穗表现出高度的抗病性或表现为一般的抗病性，这种抗性的差异反映在症状的严重度、发病时间的早晚及对病原的抑制作用等方面。充分了解不同古枣树单株的抗病特性，不仅有助于合理利用抗病资源，也有利于更有效地控制病害。保护好这些古枣树个体不仅是保护都市历史、文化遗产的重要组成部分，也是保护和丰富我国枣树遗传资源的重要举措。因而本研究结果将为这些古树具体保护措施的制定提供参考依据。当然，本研究在试验设计和调查分析方面也存在一些不足，比如某些株系虽然显示了很强的抗病潜力，但因嫁接接穗数、嫁接成活数、实际调查遗漏等问题，尚不能得出肯定的判断，如编号100的株系。另外，2013年的复选试验的2个枣园环境，特别是间作植被有明显的差异，亦可能对抗病性测定和统计分析结果的准确性产生一定的影响。这些都需要在今后的研究中加以改进和完善。

4 结论

本研究2012—2014年从北京市区未发病的古(老)枣树上采集接穗, 在病区(怀柔和昌平区)枣园嫁接到已发病砧木上，定期调查接穗的发病及生长状况，并用分子检测技术测定病原的侵染情况，用以系统评估不同株系接穗的抗病能力。2012年从怀柔嫁接处理区的140多个株系中初选了45种相对抗病的株系。2013年重新从这些株系的母树上采集接穗在昌平区的2块枣疯病严重发生的枣园进行抗病性重复测定，证明多数初选株系的抗病鉴定结果与初选结果吻合，且抗性相对稳定。在2013年和2014年对复选的接穗中当年和次年恢复正常生长和结果的株系进行了评估，从中优选出7个表现抗病能力强、抗性稳定、生长势旺、结果丰产、品质好、鲜食为主的株系作为今后品种选育和推广应用的重点对象。本研究为首次对古都老枣树开展抗病资源筛选和鉴定，通过多点、多年重复嫁接接种，嫁接后连续动态调查发病状况和高效、灵敏、准确的病原检测技术支持，采用多种统计分析比较方法对株系的抗病能力进行了全方位的考察，同时设计了多个已知抗病能力的品系作为对照。因此，本抗病性鉴定的结果具有更高的可靠性、准确性和稳定性。所筛选出的多个鲜食枣树品系的进一步推广应用将会改善我国抗枣疯病鲜食枣树品种稀缺的现状、有效防控枣疯病的危害。