木质素是一类以苯丙烷为基本单元的结构复杂且稳定的芳香族生物大分子物质(董旭杰等，2007；段传人等，2009)，同时也是地球上仅次于纤维素、第二丰富的可再生资源，约占植物生物量的25%(Adler，1977)。在自然环境条件下，木质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用的结果，其中真菌起主导作用(崔艳红等，2012)。木质素生物降解过程主要涉及3种细胞外酶：漆酶(laccase)、锰过氧化物酶(MnP) 和木质素过氧化物酶(LiP)(Abrahão et al., 2008；Leonowicz et al., 2001；苏小军等，2009；池玉杰等，2009)。laccase (EC1.10.3.2) 是一种含铜的多酚氧化酶，广泛存在于担子菌、子囊菌和植物中，其中真菌漆酶来源广泛，在合适的氧化还原辅基存在条件下，可参与木质素的降解过程(尤纪雪等，2008；金春德等，2009；王娟等，2010)。MnP (EC1.11.1.13) 是一种最常见依赖H₂O₂降解木质素的含亚铁血红素糖蛋白酶，在木腐菌和各种栖息土壤的枯落层降解担子菌中广泛存在(Orth et al., 1993；Hatakka，1994)。LiP (EC1.11.1.14) 与MnP同样也是一类含亚铁血红素辅基的过氧化物酶，最早由Glenn等(1983)从黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium) 中发现，并与其他木质素降解酶相互作用将木质素彻底氧化为CO₂和H₂O (喻云梅等，2005；王敏，2011；李阿敏等，2015)。

目前，国内外报道的产生木质素降解酶的菌株主要局限于白腐菌中的担子菌，如黄孢原毛平革菌、变色栓菌(Trametes versicolor)、糙皮侧耳(Pleurotusos treatus) 等菌种，而关于子囊菌产木质素降解酶的研究报道相对较少。Paraconiothyrium variabileGHJ-4是本实验室从泰山脚下一腐朽柳木中分离到的1株木质素降解子囊菌(GenBank注册号为GQ331986)(Gao et al., 2011)，本研究对Paraconiothyrium variabile GHJ-4菌株产生laccase，MnP和LiP的情况进行检测，并研究其酶学性质，旨在查明GHJ-4降解木质素的主要酶系，为今后利用该菌株进行木质素降解酶的工业化生产和应用以及深入研究GHJ-4降解木质素的作用机制提供依据。

1 材料与方法 1.1 菌株和培养基 1.1.1 菌株

子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4，由本实验室自行筛选并保存。

1.1.2 培养基

PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，加水定容至1 000 mL，用于GHJ-4菌株的活化。

产酶培养基：酒石酸铵10 mL (22 g·L^-1)，葡萄糖2.5 mL (200 g·L^-1)，大量元素15 mL，微量元素15 mL，VB₁ 3 mL (100 mg·L^-1)，加水至50 mL，pH 4.2。其中大量元素：KH₂PO₄ 20 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 13.8 g·L^-1，CaCl₂ 1 g·L^-1，NaCl 0.6 g·L^-1；微量元素：MnSO₄·H₂O 0.35 g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 60 mg·L^-1，CoCl·6H₂O 110 mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 60 mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 95 mg·L^-1，AlK (SO₄)₂·12H₂O 6 mg·L^-1，H₃BO₃ 6 mg·L^-1，Na₂MoO₄·2H₂O 6 mg·L^-1(张文婷，2011)。

1.2 GHJ-4的培养方法和酶液制备

在250 mL三角瓶中放入80 mL产酶培养基，接种直径为10 mm的GHJ-4菌饼3个，28 ℃、160 r·min^-1条件下进行摇床培养，于特定时间取出，4 ℃、4 000 r·min^-1离心20 min，吸取上清液为粗酶液，-80 ℃保存备用。

1.3 木质素降解酶酶活测定 1.3.1 漆酶活性的测定

采用Gao等(2013)方法，在4.0 mL含1.0 mmol·L^-1愈创木酚的50 mmol·L^-1 pH 4.5的醋酸钠缓冲液中加入1.0 mL适当稀释的酶液，充分混匀后30 ℃反应30 min，冰浴中终止反应，测定465 nm处的吸光度(ε₄₆₅=36 000 L·cm^-1mol^-1)。定义每分钟氧化1 μmol·L^-1愈创木酚所需酶量为酶活单位U，其计算公式为：

$ U = \frac{{{{10}^6} \times {V_{\rm{T}}} \times \Delta A}}{{{V_{\rm{E}}} \times \varepsilon \times \Delta t}} $

(1)

式中：V_T，V_E分别代表反应体系的总体积和反应酶液的体积；ε为吸光系数。

1.3.2 锰过氧化物酶活性的测定

采用Wariishi等(1992)方法，向pH 4.5的3.36 mL 50 mmol·L^-1的丙二酸钠缓冲液中依次加入0.2 mL 10 mmol·L^-1的MnSO₄、0.2 mL 10 mmol·L^-1的2, 6-DMP、0.2 mL酶液样品和40 μL10 mmol·L^-1的H₂O₂，25 ℃下保温5 min，于470 nm处测定吸光度(ε₄₇₀=496 000 L·cm^-1mol^-1)。定义每分钟氧化1 μmol·L^-1 2, 6-DMP所需酶量为酶活单位U，计算方法同1.3.1。

1.3.3 木质素过氧化物酶活性的测定

采用Gao等(2011)方法，在4 mL体系中加入2.5 mL酒石酸缓冲液(100 mmol·L^-1，pH 3.0)、1.0 mL 10 mmol·L^-1藜芦醇、0.1 mL 10 mmol·L^-1H₂O₂和0.4 mL酶液，于37 ℃测定酶反应前3 min内在310 nm处的吸光度(ε₃₁₀=9 300 L·cm^-1mol^-1)，酶促反应由加入H₂O₂后而启动。定义每分钟氧化1 μmol·L^-1藜芦醇所需酶量为酶活单位U，计算方法同1.3.1。

1.4 木质素降解酶酶学性质测定 1.4.1 pH对木质素降解酶活性及稳定性的影响

取适量酶液分别置于pH 2.0~9.0的缓冲体系中，测定3种酶的酶活，确定最适反应pH；将酶液置于pH 2.0~9.0的缓冲体系中25 ℃下保温1 h，测定剩余酶活，以酶活最高者为100%计算相对酶活。

1.4.2 温度对木质素降解酶活性及稳定性的影响

将酶液分别在20~90 ℃下测定酶活，确定最适反应温度；将酶液分别在20~90 ℃保温1 h后测定剩余酶活，以酶活最高者为100%计算相对酶活。

1.4.3 金属离子对木质素降解酶活性的影响

在酶液中分别加入KCl，NaCl，CaCl₂，FeCl₃，MgCl₂，ZnCl₂，MnCl₂，CoCl₂，AlCl₃，CuCl₂，(CH₃COO)₂Pb至终浓度为0.1，1.0，5.0 mmol·L^-1，25 ℃保温1 h，测定剩余酶活，以未添加金属离子的酶活为100%计算相对酶活。

1.5 数据处理

每个测试组样品平行测定3次，取平均值，所有试验数据运用Microsoft Excel数据处理系统进行统计分析。

2 结果与分析 2.1 培养时间对GHJ-4产木质素降解酶的影响

由图 1A和图 1B可知，GHJ-4菌株在接种后的第9天，laccase出现一分泌高峰，之后又经历下降、重新升高，到18天时达到最高值1 390.3 U·mL^-1；MnP和LiP的分泌规律与laccase相类似，其中MnP在第15天达到最高酶活30.3 U·mL^-1，LiP在第21天达到最高酶活52.5 U·mL^-1。因此分别选取18，15和21天的发酵液进行laccase，MnP和LiP酶学特性的测定。

2.2 pH对GHJ-4木质素降解酶活性及稳定性的影响 2.2.1 pH对GHJ-4木质素降解酶活性的影响

分别在不同pH反应体系下测定GHJ-4木质素降解酶的酶活，结果如图 2所示。由图 2可知，GHJ-4菌株laccase的最适反应pH为5.5左右，pH4.5~6.5时相对酶活在80%以上，pH＞6.5时酶活迅速下降，pH 9.0时仅有少量酶活；MnP的最适反应pH为5.0左右，pH 4.5~7.0时相对酶活为在80%以上，pH＞7.0时酶活呈现缓慢下降趋势，pH 9.0时相对酶活仍为63%；LiP的最适反应pH为3.0左右，pH 2.0~4.0时相对酶活在80%以上，pH＞4.0时酶活迅速下降，pH 9.0时已经几乎检测不到酶活。

2.2.2 pH对GHJ-4木质素降解酶稳定性的影响

将酶液置于不同pH的缓冲液中保存1 h后测定木质素降解酶剩余酶活，结果如图 3所示。由图 3可知，laccase在pH 5.0~6.5时稳定性较好，酶活可保持在80%以上，pH>7.0时酶活损失较快；MnP有较宽的pH稳定性范围，pH 4.5~9.0时酶活均保持在80%以上，pH 9.0时仍能保持81%的酶活；LiP在酸性条件下较碱性条件下稳定，pH 3.0~3.5时酶活相对稳定，保持在80%以上，pH 3.5时，酶活迅速下降，pH 7.0时，相对剩余酶活仅为40%。

2.3 温度对GHJ-4木质素降解酶活性及稳定性的影响 2.3.1 温度对GHJ-4木质素降解酶活性的影响

分别在不同温度下测定GHJ-4木质素降解酶的酶活，结果如图 4所示。由图 4可知，GHJ-4木质素降解酶均在一定温度范围内随温度升高其酶活不断增强，laccase的最适反应温度为55 ℃左右，在45~60 ℃之间均有较高酶活，相对酶活在80%以上，之后酶活迅速下降；MnP的最适反应温度为60 ℃左右，55~70 ℃之间相对酶活在80%以上，超过70 ℃酶活迅速下降；LiP的最适反应温度为40 ℃左右，35~55 ℃之间相对酶活在80%以上，超过55 ℃酶活明显下降。当反应温度为90 ℃时，3种酶酶活均检测不到。

2.3.2 温度对GHJ-4木质素降解酶稳定性的影响

将酶液分别在不同温度下保温1 h后测定剩余酶活，结果如图 5所示。由图 5可知，laccase，MnP和LiP的相对酶活随着保存温度的升高迅速下降，laccase和MnP在55 ℃以下相对稳定，当温度超过55 ℃时，酶活迅速下降；而LiP在40 ℃以下相对稳定，当温度超过45 ℃时，酶活呈现迅速下降趋势。

2.4 金属离子对木质素降解酶活性的影响

将酶液置于不同浓度的金属离子缓冲液中保存1 h后测定剩余酶活，结果如表 1所示。从表 1可看出，Mg²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺和K⁺对laccase有促进作用，Mn²⁺，Fe³⁺，Ca²⁺，Pb²⁺，Co²⁺，Na⁺，Al³⁺对laccase都表现出一定程度的抑制作用，其中Fe³⁺，Ca²⁺，Pb²⁺和Co²⁺抑制作用较强；Mn²⁺对MnP有激活作用，其他金属离子在某种程度上都存在着对MnP的抑制作用，其中Fe³⁺和Pb²⁺抑制作用最为明显；Na⁺，Zn²⁺对LiP具有激活作用，而其他金属离子均存在不同程度的抑制作用，其中Mg²⁺，Fe³⁺，Ca²⁺，Pb²⁺，Co²⁺，Al³⁺的抑制作用较强。可见Fe³⁺和Al³⁺对3种酶都存在着一定程度的抑制作用，其中Fe³⁺为5 mmol·L^-1时抑制作用最强。

3 讨论

关于木腐真菌培养条件的研究报道，不同菌株即使是同一菌株不同培养条件，其产酶的最佳时间也不相同。laccase的最佳产酶时间为36 h~32天(周菲，2011；宋安东等，2005)，MnP的最佳产酶时间为7~24天(张连慧，2005；宋安东等，2005)，LiP的最佳产酶时间为4~24天(杨暖，2009；宋安东等，2005)。本文通过研究GHJ-4所分泌的3种木质素降解酶随时间的变化规律，得到laccase，MnP和LiP的最佳产酶时间分别为18，15和21天，这与前人的研究结果基本一致。

关于木质素降解酶酶学性质的研究，大多认为laccase的最适反应温度为20~65 ℃，温度稳定性为25~60 ℃；最适反应pH为4.0~5.5，pH 3.5~8.0范围内均有较高酶活(董学卫等，2007；赵晓燕等，2012；肖楚等，2011；王维乐，2011)。MnP的最适反应温度为35~55 ℃，温度稳定性为20~50 ℃，最适反应pH为3.0~7.0，pH 2.5~9.0范围内均有较高酶活(程晓滨，2007；吴会广，2008；白娜，2010)。LiP的最适反应温度为35~50 ℃，温度稳定性为15~60 ℃，最适反应pH为2.5~7.0，pH 2.0~9.0范围内均有较高酶活(孔令营等，2010；杨暖，2009；金剑等，2010)。本研究中GHJ-4分泌的laccase最适反应温度55 ℃，55 ℃以下相对稳定，最适反应pH为5.5，pH 4.0~7.0稳定性较好；MnP最适反应温度60 ℃，55 ℃以下相对稳定，最适反应pH为5.0，pH 4.0~9.0较为稳定；LiP最适反应温度40 ℃，40 ℃以下稳定，最适反应pH为3.0，pH 2.0~4.0稳定。这表明LiP较laccase和MnP热稳定性差，laccase, LiP较MnP的pH稳定性范围窄，与其他白腐真菌木质素降解酶相比，除MnP最适反应温度略高外，其他酶学性质基本一致。

本研究中Mg²⁺，Zn²⁺，Cu²⁺，K⁺对laccase起激活作用，Na⁺和Zn²⁺对LiP起促进作用，Mn²⁺对MnP起促进作用，而Fe³⁺，Ca²⁺，Pb²⁺，Co²⁺，Al³⁺对3种酶都起抑制作用，其中以Fe³⁺的抑制作用最明显，浓度为5 mmol·L^-1时，对3种酶活性的抑制率达到80%~100%，这与其他报道(肖楚等，2011；王维乐，2011；吴会广，2008；徐淑霞等，2007；金剑等，2010；张莉，2009) 有很大不同，说明同种金属离子对不同菌种木质素降解酶的影响不同，可能与其化学组成和分子结构不同有关。

为了更好地将GHJ-4进行工业应用，目前本实验室正通过对其降解酶进行分子改造和异源表达来进一步提高其反应温度和pH，相关研究正在进行中。

4 结论

本研究通过对木质素降解子囊菌Paraconiothyrium variabile GHJ-4进行发酵培养，明确了GHJ-4所分泌的3种木质素降解酶随时间的变化规律；通过研究金属离子对GHJ-4产3种木质素降解酶活性的影响，证明即使是同种金属离子对不同菌种木质素降解酶的影响也不同，这可能与其化学组成和分子结构不同有关。研究结果为下一步进行该菌株木质素降解酶的分子改造以及木质素降解研究提供了重要的理论依据，对该菌株木质素降解酶的工业化生产、开发和利用具有重要的理论和实践意义。