黄腐酸(fulvic acid，FA)是腐植酸(humic acid，HA)中分子量最小、水溶性最好、生物活性最高的组分(郑平，1991；王天立等，1996；王秀飞等，2013)，其在农业、林业上的应用效果，包括促进生长、增强抗性、改善品质、增加糖分含量乃至影响植物内生菌群落和动态等效果已经得到了普遍的证实和应用(Rauthan et al., 1981；Ali et al., 2015；Yu et al., 2015;杨光滢等，1996；张士权，2002；杨宇等，2010；李艳红，2014)。传统的黄腐酸一般从煤炭来源的腐植酸中分离获得或直接从泥炭、风化煤中提取获得，后来可以用农林下脚料通过人工发酵制造黄腐酸，前者称矿源黄腐酸(mineral fulvic acid，MFA)，后者称为生化黄腐酸(biochemical fulvic acid，BFA)。BFA是20世纪后期开发成功的新产品(何立千，1999；沈玉龙等，2002；刘陶等，2006；赵莹等，2010)，是一类成分复杂的天然有机物，是秸秆及木屑等废弃资源在微生物发酵作用下经过复杂的生物、化学的分解及合成反应生成的含有多种活性基，如羧基、羟基、酚羟基、甲氧基、醌基等多种小分子有机物的混合产物。BFA中碳含量低于一般MFA, 而氢含量和氮含量均高于MFA，与泥炭黄腐酸元素组成更为接近(王秀飞等，2013)。由于其来源的特殊性，使得BFA在其组成上与其他来源的腐植酸或黄腐酸物质既有共性，又有其自身的特点。BFA与MFA相比，分子量更小、生物活性更高、水溶性更好、抗硬水能力更强，并且具有更高比例的官能团，使其络合、螯合能力更强，其絮凝极限也明显高于MFA(王秀飞等，2013)。

迄今为止，BFA的发酵基本上还以固体发酵为主(赵莹等，2010)，而通过液体发酵生产BFA的报道却极少(刘陶等，2006)，这是由于固体发酵的原材料来源广泛，成本低廉，工艺相对粗放易于操作。笔者发现，二次发酵利用废糖蜜(酒精发酵废液浓缩液，也称为渍水)在产糖地区是一种季节性排放的废弃资源，得到了部分利用，而由于排放量巨大，往往形成季节性的排放压力，成本低廉，其本身经过酵母发酵，含有一定量的MFA，但转化不彻底，是进一步加工制造生MFA的优良原材料，加工后无须提纯即可投入应用。糖蜜酒精废水中的固形物大约70%为有机质，其中有糖分、蛋白质、氨基酸和维生素等，其余为灰分，含有氮、磷、钾、钙、镁等元素，钾含量高, 重金属痕量，无毒、无害。从成分上看，糖蜜发酵酒精废液是可以开发的宝贵资源。但由于成分复杂，尚未查阅到利用酒精发酵废液浓缩液生产BFA的报道，本研究在实验室水平利用3种微生物进行发酵条件的优化，为生化黄腐酸高效生产提供理论依据。

1 试验材料 1.1 糖蜜酒精发酵废液(渍水)

产糖季节从广西南宁、合浦和广东湛江酒精厂或市场购买当年产出的糖蜜发酵酒精废液(浓缩液)。糖蜜发酵酒精废液原料用水调至固形物含量40%左右，作为基础培养基糖蜜发酵酒精废液原料。

1.2 其他原料

甘油、蔗糖、葡萄糖、糊精、麸皮、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、尿素、硫酸铵等，为食品级或工业级。

1.3 菌种

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，白地霉(Geotrichhum candidum)和黑曲霉(Aspergillus niger)，均为美国引进菌种。

1.4 培养基 1.4.1 短小芽孢杆菌培养基

斜面培养基为NBY；摇瓶种子培养基：葡萄糖30.0 g·L^-1，蛋白胨10.0 g·L^-1，酵母膏1.0 g·L^-1，磷酸氢二钾0.5 g·L^-1，氯化钠5.0 g·L^-1，调pH至7.5左右灭菌。1.4.2黑曲霉和白地霉培养基斜面培养基为PDA；摇瓶种子培养基：葡萄糖10.0 g·L^-1，麸皮浸提液30.0 g·L^-1，装量100 mL/500 mL。摇瓶基础培养基：糖蜜酒精发酵废液800 g·L^-1，葡萄糖10.0 g·L^-1，尿素5.0 g·L^-1，以水补足，用KOH调整pH值为6.8~7.0。

1.4.2 黑曲霉和白地霉培养基

斜面培养基为PDA;摇瓶种子培养基:葡萄糖10.0 g·L^-1,麸皮浸提液30.0 g·L^-1,装量100 mL/500 mL。摇瓶基础培养基:糖蜜酒精发酵废液800 g·L^-1,葡萄糖10.0 g·L^-1,尿素5.0 g·L^-1,以水补足,用KOH调整pH值为6.8~7.0。

2 研究方法 2.1 生化黄腐酸含量测定

采用硫酸铝絮凝质量法(丁为民等，2003)。

2.2 菌种培养

黑曲霉菌种：在斜面培养基上活化后，接种到摇瓶种子培养基中，装量100 mL/500 mL。25~27 ℃震荡培养30~36 h，菌丝均匀成球，镜检无杂菌，100倍稀释液的OD₆₆₀为0.1~0.15，即可备用。

白地霉菌种：参照黑曲霉参数，但培养温度为28~30 ℃。

短小芽孢杆菌菌种：在斜面培养基上活化后，接种到摇瓶培养基中，装量100 mL/500 mL。调pH至7.5左右灭菌。32~35 ℃震荡培养培养20~24 h，要求镜检无杂菌，血球计数板计数，菌数应达到5.0×10⁸cfu·mL^-1以上。

2.3 菌种配比试验

所用菌种为黑曲霉(A)、白地霉(G)、短小芽孢杆菌(B)，将培养好的摇瓶种子液，按每个菌种接种水平分别为1和2，采用L₄(2³)正交试验，总接种量为5%，接种到装液量为100 mL/500 mL三角瓶的基础培养基上，转速240 r·min^-1，发酵温度28~30 ℃，发酵周期72 h后，分别进行BFA含量测定。

2.4 C源试验

在基础培养基中分别略去葡萄糖等碳源成分，外加碳源进行筛选试验，碳源分别选取甘油、葡萄糖、蔗糖、糊精作为试验对象，浓度分别为10.0，40.0，70.0 g·L^-1，并在每个处理中添加了3 g·L^-1(NH₄)₂SO₄·7H₂O，接种量5%(V/V)，摇瓶装量o 100 mL/500 mL瓶，转速240 r·min^-1，分别在48, 60, 72, 84, 96 h取样测定BFA含量。

2.5 N源试验

在基础培养基中分别去除尿素氮源成分，外加氮源进行筛选试验，氮源分别选取鱼肉蛋白胨、大豆蛋白胨和尿素作为试验对象，浓度分别为10.0，20.0，30.0 g·L^-1，并在每个处理中添加3.0 g·L^-1(NH₄)₂SO₄·7H₂O，接种量5%(V/V)，摇瓶装量为100 mL/500 mL瓶，转速240 r·min^-1，分别在48, 60, 72, 84, 96 h取样测定BFA含量。

2.6 培养基条件优化正交试验

根据初试结果，并考虑废弃物利用的适用性和最终发酵物应保持良好的水溶性，以及在同样条件下原材料的成本因素，确定选取外加碳源为葡萄糖，氮源选择为尿素和硫酸铵[(NH₄)₂SO₄·7H₂O]组合作为优化对象，以葡萄糖、尿素、硫酸铵、接种量、发酵时间5个因素采用L₁₆(4⁵)正交试验。

3 结果与分析 3.1 不同批次原材料的黄腐酸含量

糖蜜发酵酒精废液本身经过发酵过程，含有一定量的生化黄腐酸，对从广西南宁、广东湛江采集的共6批次糖蜜发酵酒精废液进行固形物含量、黄腐酸含量、灰分含量测定，结果见表 1。

由表 1可知，不同来源的糖蜜发酵酒精废液固形物含量和灰分含量相差不大，但是黄腐酸含量则相差较大，这是因为不同来源的废液形成时间不同，存放的方式也不同，在存放过程中会有一些自然发酵和转化造成的；来自商家的原料黄腐酸含量高于直接来自厂家的，是因为商家的原料废液存放时间较长因而自然发酵的时间也更长。因此本研究采用的为广西合浦厂家的原料。

3.2 菌种配比试验

以基础培养基为试验培养基，采用L₄(2³)正交试验：3个菌种黑曲霉(A)、白地霉(G)、短小芽孢杆菌(B)，每个菌种接种水平分别为1和2，总接种量取5%(V/V)，摇瓶装量为100 mL/500 mL三角瓶，转速240 r·min^-1，30 ℃发酵周期72 h, 结果见表 2。

由表 2可知，不同菌种添加比例的黄腐酸含量差异显著，其中，以黑曲霉:白地霉:短小芽孢杆菌=1:1:2生化黄腐酸含量达到236.5 g·L^-1，效果最佳，可作为培养条件优化的接种比例。

3.3 培养条件初试

在基础培养基中分别略去葡萄糖、尿素等碳源和氮源成分，外加碳源和氮源，进行碳、氮源的筛选试验。选取甘油、葡萄糖、蔗糖、糊精作为碳源，浓度分别设定为10.0，40.0，70.0 g·L^-1 3个水平；取普通蛋白胨、大豆蛋白胨和尿素为氮源，浓度分别设定为为10.0，20.0，30.0 g·L^-1 3个水平，并在每个处理中添加了3.0 g·L^-1(NH₄)₂SO₄·7H₂O，接种量5%(V/V)，摇瓶装量为100 mL/500 mL三角瓶，转速240 r·min^-1，分别在48, 60, 72, 84, 96 h取样测定生化黄腐酸含量。结果见表 3，4。

由表 3和表 4可知：1)单项碳源比较，以葡萄糖为最佳，甘油和蔗糖次之，糊精最差，葡萄糖浓度达到70.0与40.0 g·L^-1时结果无显著差异，尚需确定最适浓度；2)单项氮源比较，总体上以大豆蛋白胨最佳，与普通蛋白胨差异不显著，但是最高值在2%尿素为氮源的72 h时BFA含量最高，尿素质量浓度为30 g·L^-1时显然阻碍BFA的合成；3)最佳发酵周期除糊精为碳源的处理之外，基本都在72~96 h，推测是因为糊精的利用速度不及葡萄糖、蔗糖和甘油。总之72 h之后生化黄腐酸(BFA)增量减小。

3.4 培养条件优化

根据初试结果，并考虑废弃物利用的适用性和最终发酵物应保持良好的水溶性，以及在同样条件下原材料的成本因素，确定选取外加碳源为葡萄糖，氮源选择为尿素和硫酸铵[(NH₄)₂SO₄·7H₂O]组合作为优化对象，以这3种原料并和接种量、发酵时间5个因素采用L₁₆(4⁵)正交试验，设计方案见表 5，正交试验结果见图 1和表 6。

通过正交试验各因素极差分析可看出，5个参试因素中，对生化黄腐酸产量影响大小顺序依次为：葡萄糖加量＞发酵周期＞尿素加量＞接种量＞硫酸铵加量。

从图 1知各单因子对黄腐酸合成的影响趋势，葡萄糖含量在50 g·L^-1以下时，黄腐酸产量随着糖浓度增加而增加，糖浓度超过50 g·L^-1之后，则黄腐酸产量呈下降趋势。这可能是因为糖蜜发酵酒精废液里干物质含量高，成分复杂，尚存有比较多的可利用碳源，碳源浓度过大反而不利于黄腐酸合成，以50 g·L^-1为最佳。尿素含量、硫酸铵含量则分别在10.0和60.0 g·L^-1时最佳，接种量大小对黄腐酸产量影响不大，接种量增加，黄腐酸产量呈微弱上升趋势。发酵周期72~96 h与黄腐酸产量呈正相关，96 h之后基本趋于平衡。

继续对单因素方差分析及Duncan多重比较分析，结果表明，50.0 g·L^-1葡萄糖加量与10.0，30.0 g·L^-1加量之间差异显著，与70.0 g·L^-1加量则差异不显著；发酵周期48 h与各其他水平之间差异均达到显著水平，而72, 96, 120 h各水平之间差异则均未达到显著水平，其他3个因素各水平之间差异均未达到显著水平。

4 讨论

对于农林业及工业下脚料一般都是采取生物降解生产黄腐酸，近年也有利用化学裂解的方式从农林业下脚料制备黄腐酸类物质的报道(Placido et al., 2015)，但迄今国内外有关BFA生产的公开报道都是以固体发酵为主，液体发酵方面只有极个别报道。而国外关于液体状态下黄腐酸的合成与去向的研究多为物质转换以及环境保护(Miller et al., 2009；Mohammadzadeh et al., 2011)。

利用糖蜜发酵酒精废液(渍水)作为主要发酵原料生产生化黄腐酸尚无公开报道，可能是因为这种废液本身就是发酵产品的附属物，成分复杂，且经过浓缩后自身就含有一定的黄腐酸类物质，故而很多时候粗放地将其直接使用或进行排放。糖蜜发酵酒精废液(渍水)是市场上资源最充足、价格最低廉的生化黄腐酸原材料，具有巨大的开发前景。但是由于缺乏科学数据的积累，直接大量使用有可能造成非预期的结果，某些地区的甘蔗等作物生长曾经因此受到严重抑制而造成损失。通过微生物发酵进一步转化提高生化黄腐酸的含量及品质，可以使资源利用的价值更大化，产品更加标准化和具有科学依据，同时也为季节性大量排放的糖蜜发酵酒精废液提供一条更科学的出路。

黄腐酸的含量测定目前还存在方法没有完全统一标准的问题，而酒精废液里几乎全部为可溶性物质，有机质含量达到70%以上，所以一些传统的分析方法以Tinsley等(1961)的“容量法”为基础，适合于煤炭来源的黄腐酸测定，但对于成分复杂的生化黄腐酸来说，分析方法容易将很多不符合黄腐酸范畴的物质认定为黄腐酸类物质，测定误差较大。由于Stevenson等(1982)发现硫酸铝能选择性地使黄腐酸沉淀而不受一般有机物干扰，本文采用由此法衍生而来的硫酸铝沉淀质量法(丁为民等，2003)，使得测定的精确度大大提高。同时，由于黄腐酸类物质特别是生化黄腐酸，组成更为复杂，因此对于这类资源，除了研究其合成基础和测定方法，实际的应用效果尤为重要。经过本试验混合菌种的转化，黄腐酸含量得到明显提高，而且其应用效果也已经得到了证实(另文报道)。

黄腐酸在林业生产上应用广泛，施用黄腐酸增加盐碱地枸杞(Lycium chinense)苗木的成活率(杨光滢等，1996)；黄腐酸可抑制欧美杨(opulus euramericana)气孔导度，降低蒸腾速率，促进光合作用，有效阻止苗木叶水势的下降(武应霞等，2008)；提高石质山地油松(Pinus tabulaeformis) (王艳丽，2016)和樟子松(P.sylvestris var.mongolica) (王洪江，2015)造林成活率和保存率；促进野橄榄林氮和叶绿素生长以抵消微量元素对土壤的污染(Murillo et al., 2005)。利用生物技术的方法以农林下脚料为原料液体发酵制造的黄腐酸，缩短了发酵周期，降低了生产成本，加工后无需提纯即可投入到林业生产，具有广阔的应用前景。

5 结论

本文研究以短小芽孢杆菌、白地霉和黑曲霉混合发酵可显著提高糖蜜发酵酒精废液中黄腐酸类物质的含量；发酵中，原料须经过稀释和外加碳氮源。通过正交试验得到最佳发酵条件为：黑曲霉:白地霉:短小芽孢杆菌=1:1:2，葡萄糖50.0 g·L^-1，尿素10.0 g·L^-1，硫酸铵60. g·L^-1，发酵周期72 h；通过各因素极差分析得出，5个参试因素中对生化黄腐酸产量影响大小顺序依次为：葡萄糖加量＞发酵周期＞尿素加量＞接种量＞硫酸铵加量。接种量虽然在3%~12%(V/V)之间，差异不大，但从常规发酵防止染菌的角度考虑，可取用5%~10%(V/V)。在试验中，发酵液中黄腐酸含量最高达到27.89%。