自1983年世界上培植出第1株转基因植物以来，国际上对转基因生物技术的安全问题一直存在争论。在林木方面，通过转基因手段已获得了耐盐(杨春霞等，2009)、抗虫(Zhang et al., 2011;Génissel et al., 2003)、抗除草剂(Confalonieri et al., 2000)、降低木质素含量(Eriksson et al., 2000)、增加生长量(Shani et al., 2004)等转基因树木，为林木遗传改良提供了新途径。但是，随着转基因产品的推广，人们对转基因产品安全性的质疑逐渐显现，转基因植物在实际推广之前必须进行安全性评估。

目前，转基因植物风险评估(Wolfenbarger et al., 2000)主要集中在转基因植物与近缘物种的外源基因的转移(顾立江等，2009)、目标害虫的抗性(郭文娟等，2012)，以及转基因植物对非目标生物的多样性和生态系统的影响(Zhang et al., 2011)等方面。土壤是农业生产中物质转化与能量交换的重要场所，在农业生态系统中处于核心地位(李鑫等，2012)。外源基因的表达可引起植物生理代谢发生改变，同时外源基因的表达产物(如Bt毒蛋白)通过根系分泌等途径进入土壤生态系统后可能会对根际微生物群落产生潜在影响。因此，转基因植物对土壤生态环境、土壤微生物群落结构和多样性的影响是转基因植物生态评价中的重要内容。

国内外关于转基因植物对土壤生态系统的研究较多，且多集中在棉花(Gossypium spp.)、玉米(Zea mays)等1年生农作物上(Oliveiraa et al., 2008;Li et al., 2013;)，关于转基因林木对土壤微生物多样性影响的研究报道很少，而且研究方法主要以传统的培养法为主(侯英杰等，2009;魏冰等，2009;胡建军等，2004)。本研究以转5个基因的杨树为研究对象，前期已经对转多基因库安托杨(Populus×euramericana'Guariento')在稳定性、抗虫、抗水淹、盐胁迫等方面进行了研究，抗逆效果都比较好(Su et al., 2011;李环等，2010)，而且发现转多基因库安托杨在调查的2年内并未对种植地内的土壤微生物数量造成影响(侯英杰，2008)。因此，本研究选择在微生物数量最多的7月份利用Biolog生态板，从根际土壤微生物群落利用碳源能力出发，探讨不同转基因杨树无性系对根际土壤微生物多样性的影响，为转基因杨树安全性评估提供参考。

试验地位于北京市房山区韩村河东营苗圃，试验品种为库安托杨，于2006年春季造林，造林面积为0.66 hm²。每个无性系按正方形种植100株(行列各10株)，造林密度为2 m×2 m。试验地的地势、地貌、气温、降雨、植被、栽培管理等自然条件和人为管理均一致，在整个试验阶段林地不做任何肥水及喷施农药管理。

本研究以转枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因(SacB)、透明颤菌血红蛋白基因(Vgb)、双价抗蛀干害虫基因(BtCry3A+OC-Ⅰ)及调节基因JERF36^#等5个外源基因，经PCR、Southern杂交和BtCryA ELISA等分子检测，其中有5个无性系同时含有上述5个基因(Wang et al., 2007)，无性系编号为依次D5-9，D5-19，D5-20，D5-21和D5-24，非转基因编号为CK，无植物种植的土壤编号为NP(No plant)。于2013年7月树木生长旺盛期，每个无性系各选取3株，在每株树木主干周围50 cm范围内，将深度15~30 cm土层内的根系挖出，采集根上附着的土壤，混合均匀，空白土壤样品取自相同深度的无植物种植的土壤。剔除石砾和植物残根等杂物的土样用无菌的封口袋包扎密封，置于冰盒中带回实验室，研碎混匀，过2 mm筛，然后进行Biolog测定。

Biolog生态板(美国BIOLOG公司)上包含用于微生物群落分析最常用的31种碳源。每块板上有96孔，分为3组，每组有31种碳源和1个阴性对照。每块板上加入同一样品后，可以获得3组平行数据。参考Classen(2003)的方法，首先将土壤样品在25℃培养箱内活化24 h，称取相当于10 g烘干质量的新鲜土壤于250 mL三角瓶中，加入90 mL灭菌的NaCl(0.154 mol·L^-1)溶液，将三角瓶在漩涡振荡器上震荡1 min，然后置于冰水浴中1 min，反复3次。静置2 min后用灭菌的NaCl溶液配置成10^-3(V:V)土壤悬浮液。用八通道移液器向ECO板每孔中加入150 μL的土壤悬浮液，将接种好的生态板放在25℃恒温培养，每个处理重复3次。每隔24 h在Molecular Devices多功能酶标仪(SpectraMax Paradigm，USA)上测定波长为590 nm处的吸光度值，即平均颜色变化率(average well colour development，AWCD)，连续测定11天。

采用培养72 h OD值表征BIOLOG 板中微生物代谢功能多样性特征，并利用Shannon-Wiener指数(H)、Simpson 指数(D)、McIntoch指数(U)计算其多样性，其公式分别为：

数据经Excel 2003整理后，采用SPSS17.0统计分析软件进行单因素方差(One-way ANOVA)分析、相关性分析和主成分分析。

如图 1所示，随着培养时间的延长，不同无性系根际土壤微生物利用碳源的总量均呈逐渐增加的趋势。培养起始的24 h为土壤微生物的滞后期，AWCD较小，且变化趋于平缓，说明碳源基本未被利用。温育24 h后，土壤微生物逐渐适应了Biolog微平板基质环境，随后进入对数增长期，AWCD快速增加，直至96 h，此时微生物活性旺盛，碳源开始被明显利用，随后缓慢增长，直至趋于稳定。不同无性系根际微生物对单一碳源利用程度存在差异：D5-24>CK>D5-20>D5-9>D5-21>D5-19>NP。其中：各培养阶段D5-24根际土 的AWCD均 最高，表明其微生物群落的碳源利用量最多，代谢活性最强;CK根际土次之;而NP土微生物代谢最慢，活性最弱。这说明栽植杨树后根际土壤 碳源丰富，从而促进了微生物的代谢活性。从表 2可 知，微生物培养72 h各无性系根际土壤微生物的AWCD在0.29~1.04之间，差异达显著水平(P < 0.05)。

	图 1 土壤微生物群落AWCD随培养时间变化 Fig. 1 AWCD changes with incubation time of different treatments

土壤微生物群落对不同碳源的利用情况可以用多样性指数表示。土壤微生物培养72 h的丰富度指数、优势度指数和均匀度指数如表 2所示，其中，D5-24各项指数最高，而NP最低。

表 2 土壤微生物群落72 h AWCD和多样性指数^① Tab.2 AWCD of 72 h for soil microbial communities and diversity indices

表 2土壤微生物群落72 h AWCD和多样性指数① Tab.2 AWCD of 72 h for soil microbial communities and diversity indices 处理Treatments 72 h AWCD H D U NP 0.285 9±0.016 9dD 2.822 7±0.029 3cCD 0.924 6±0.002 1cdeBC 2.431 5±0.110 4dC CK 0.799 8±0.095 7bcAB 2.799 3±0.050 7cCD 0.922 1±0.007 3deBC 2.984 5±0.235 8cdC D5-9 0.449 3±0.046 1dCD 2.881 6±0.143 3cBC 0.929 3±0.012 3cdBC 3.681 8±0.296 1cBC D5-19 0.374 5±0.034 8dD 2.611 8±0.107 4dD 0.912 0±0.009 4eC 3.432 6±0.218 1cC D5-20 0.932 1±0.071 4abA 3.092 5±0.047 8abAB 0.950 2±0.003 1abA 6.436 4±0.330 2aA D5-21 0.641 9±0.215 8cBC 2.940 2±0.111 9bcBC 0.937 4±0.010 1bcAB 4.890 1±1.374 7bB D5-24 1.043 4±0.059 9aA 3.195 7±0.063 2aA 0.955 1±0.003 3aA 6.838 8±0.145 5aA ① 表中数据为均值±标准差，不同大、小写字母分别表示不同处理间的差异极显著( P＜0.01)和显著(P＜0.05)。 Data are mean ±SE, different capital and lowercase letters in the same column mean significant difference among treatments at 0.01 and 0.05 levels, respectively.

通过检测6大类碳源的利用强度(图 2)可以看出，土壤微生物对胺类、酚酸类、羧酸类、多聚物、氨基酸和碳水化合物的利用强度存在差异。NP和D5-19的根际土壤微生物对碳源的利用表现为碳水化合物>氨基酸>多聚物>羧酸类>酚酸类>胺类;CK，D5-9，D5-20和D5-21的根际土壤微生物对碳源的利用表现为碳水化合物>氨基酸>多聚物>羧酸类>胺类>酚酸类;D5-24根际土壤微生物对碳源的利用表现为:碳水化合物>氨基酸>羧酸类>多聚物>酚酸类>胺类。可见微生物对碳水化合物和氨基酸的代谢比较旺盛而对酚酸类和胺类的代谢较弱，转基因和非转基因与NP之间无明显差异。

	图 2 不同转基因无性系对土壤微生物利用不同碳源类型的影响 Fig. 2 Effect of different transgenic poplars on utilization of different types of carbon sources by microbes

主成分分析是处理数学降维的一种方法，即将不同样本的多元向量变换为互不相关的主元向量，在降维后的主元向量空间中可以用点的位置直观地反映不同样本微生物群落的代谢特征，用于解释微生物利用碳源的多样性。对土壤微生物群落培养72 h利用6类碳源的情况作主成分(PCA)分析(图 3)，结果表明，31个主成分因子中前20个的方差贡献率达100%，其中主成分1(principal component 1，PC1)的方差贡献率为42.31%，主成分2(PC2)为13.57%，第3-20主成分贡献率较小，为1.32%~11.64%。PC1和PC2的累积贡献率高达55.88%，是变异的主要来源，可以解释变量的绝大部分信息。分析结果(表 3)显示:对PC1贡献大的碳源有24种，包括碳水化合物(11种)、氨基酸占(6种)、羧酸类(3种)、酚酸类(2种)、胺类(1种)、多聚物(1种);对PC2贡献大的碳源有6种，包括氨基酸(2种)、胺类(1种)、羧酸类(1种)、多聚物(1种)、酚酸类(1种)。相关性分析表明:与PC1正相关程度最高的碳源为D-纤维二糖(0.900)，负相关的碳源为衣康酸(-0.266);与PC2正相关程度最高的碳源为苯乙胺(0.668)，负相关的碳源为α-丁酮酸(-0.631)。

	图 3 31种主成分的方差贡献率 Fig. 3 Variance percent of 31 principal components

表 3 31种碳源的主成分载荷因子 Tab.3 Loading factors of principle components of 31 sole-carbon sources

表 331种碳源的主成分载荷因子 Tab.3 Loading factors of principle components of 31 sole-carbon sources 碳源化学类别Chemical guild 碳源类型Carbon source 第1主成分PC1 第2主成分PC2 碳水化合物Carbohydrates D-半乳糖酸-γ-内脂 D-galactonic acid γ-lactone 0.587 -0.312 β-甲基-D-葡萄糖苷 β-methyl-D-glucoside 0.883 -0.301 D-纤维二糖 D-cellobiose 0.900 -0.132 α-D-乳糖 α-D-lactose 0.735 0.035 i-赤藓糖醇 i-erythritol 0.767 -0.035 α-D-葡萄糖-1-磷酸 α-D-glucose-1-phosphate 0.895 -0.372 D-木糖 D-xylose 0.876 -0.181 D-甘露醇 D-mannitol 0.841 -0.244 N-乙酰-D-葡萄糖胺 N-acetyl-D-glucosamine 0.867 -0.250 D,L-α-磷酸甘油 D,L-α-glycerol phosphate 0.528 -0.346 D-半乳糖醛酸 D-galacturonic acid 0.493 -0.244 D-葡萄糖胺酸 D-glucosaminic acid 0.670 -0.063 氨基酸Amino acids L-天门冬酰胺 L-asparagine 0.533 0.285 L-苯基丙氨酸 L-phenylalanine 0.72 -0.496 L-精氨酸 L-arginine 0.631 0.564 L-丝氨酸 L-serine 0.705 0.299 L-苏氨酸 L-threonine 0.516 0.556 甘氨酰-L-谷氨酸 glycyl-L-glutamic acid 0.669 0.294 羧酸类Carboxylic acids γ-羟基丁酸 γ-hydroxybutyric acid 0.602 0.150 衣康酸 Itaconic acid -0.266 0.505 α-丁酮酸 α-ketobutyric acid 0.181 -0.631 D-苹果酸 D-malic acid 0.726 0.476 丙酮酸甲酯 Pyruvic acid methyl ester 0.511 0.313 多聚物Polymer α-环式糊精 α-cyclodextrin 0.490 0.563 肝糖 Glycogen 0.436 -0.430 吐温40 Tween 40 0.421 0.190 吐温80 Tween 80 0.584 -0.240 酚酸类Phenolic acids 2-羟基苯甲酸 2-hydroxybenzoic acid 0.661 0.530 4-羟基苯甲酸 4-hydroxybenzoic acid 0.723 0.100 胺类Amine 苯乙胺 Phenylethylamine 0.464 0.668 腐胺 Putrescine 0.521 -0.243

分析结果(图 4)表明:不同无性系在PC1轴上都在正向分布，NP和CK分别分布在最小和最大两端。在PC2轴上NP和D5-9分布在正向，D5-20和D5-24分布在负向，CK，D5-19和D5-21两边均有分布，NP与其他无性系之间的分布区域有明显差异，而转基因与非转基因之间分布区域差异不明显。

	图 4 土壤微生物群落碳源利用图谱主成分分析 Fig. 4 Principal components analysis of carbon utilization

自转基因作物商业化种植以来，其对环境的影响一直备受关注。转基因植物在田间种植可通过根茬、残枝落叶、根系分泌物等途径，将外源基因及其表达产物带入土壤生态系统，从而可能对土壤微生物数量和生物多样性及土壤养分的释放和有效性等产生影响(Dunfield et al., 2004;Wang et al., 2004)。但这些改变也同时受田间土壤性质、季节变化和评估方法等的影响(唐影等，2007)。目前关于转基因作物对土壤微生物组成和种类的影响研究结果不尽相同。Dunfield等(2001)研究了4种转除草剂基因的油菜(Brassica napus)和4种常规油菜品种对根际微生物多样性的影响，结果发现转基因油菜的根际微生物群落对一些脂肪酸的利用与常规油菜品种相比显著增多，表明其微生物群落组成发生了变化。而陈国华等(2013)在研究转基因黄瓜(Cucumis sativus)时发现未对根际土壤细菌群落产生明显影响。在林业方面通过可培养微生物方法研究认为转基因欧洲黑杨(P.nigra)、转基因银腺杂种杨(P.alba×P.gl and ulosa)和转基因毛白杨杂种[(P.tomentosa×P.bolleana)×P.tomentosa](侯英杰等，2009;魏冰等，2009;胡建军等，2004)等转基因树木对土壤微生物也没有显著影响。本研究对转多基因的库安托杨5个无性系(D5-9，D5-19，D5-20，D5-21和D5-24)、非转基因无性系(CK)的根际土壤，以及无植物种植(NP)的土壤微生物进行Biolog分析，通过对转基因杨树与非转基因杨树和无植物种植的AWCD值、Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数变化进行比较分析，发现转基因无性系D5-24的所有指标都是最高，而转基因无性系(D5-9，D5-19)的AWCD值有所降低但都高于对照(无植物种植)。不同转基因无性系之间的差别可能是由于外源基因插入位置、拷贝数等差异导致植株的生理生化及代谢特性发生变化，而非基因表达产物本身的影响。但是不论栽植非转基因杨树还是转基因杨树都会增加根际土壤微生物的代谢活性。主成分分析解释了不同无性系根际土壤微生物碳源利用存在的差异，不同无性系在PC1轴上都呈正向分布无明显差异。在PC2轴上NP和D5-9分布在正向，D5-20和D5-24分布在负向，CK、D5-19和D5-21两边均有分布，NP分布独立于其他无性系，可见转基因与非转基因之间分布界线不明显。该结论与金凌波等(2012)和阮妙鸿等(2008)应用Biolog方法在转基因作物领域的研究结果类似。

本试验通过Biolog生态板，对转基因杨树根部土壤中微生物的碳代谢进行了比较系统的研究，结果表明，SacB等5个外源基因的转入对于杨树根部土壤微生物系统未发现明显影响。对于田间生态安全性评价，由于立地条件等各项生态影响因子很难控制，给检测增加了难度，所观察到的转基因植物对土壤微生物的影响常是不稳定的，因此对转基因林木生态安全性的了解还需要进行长期、深入、系统的研究。本研究为转基因库安托杨的商业化种植提供了一定的依据和参考。但是由于技术的局限性，仅采用此技术还不能完整地反映土壤微生物群落功能多样性变化规律，随着研究的深入和测试技术的改进，结合其他土壤微生物研究方法，如磷酸脂肪酸(phospholipid fatty acid，PLFA)谱图分析法、分子生物学技术(如PCR-DGGE)，可更全面、客观地评价转基因杨树对土壤微生物群落的影响。