林业科学  2015, Vol. 51 Issue (11): 60-68   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20151108
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文章信息

孙晓明, 严东辉, 贺伟, 张星耀
Sun Xiaoming, Yan Donghui, He Wei, Zhang Xingyao
基于杨生褐盘二孢菌2个专化型的ITS2二级结构特征分析
Characteristics of ITS2 Secondary Structure of Marssonina brunnea Two Formae Speciales
林业科学, 2015, 51(11): 60-68
Scientia Silvae Sinicae, 2015, 51(11): 60-68.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20151108

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收稿日期：2014-12-19
修回日期：2015-05-12

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孙晓明
严东辉
贺伟
贺伟

引用本文
孙晓明, 严东辉, 贺伟, 张星耀. 2015. 基于杨生褐盘二孢菌2个专化型的ITS2二级结构特征分析[J]. 林业科学, 51(11): 60-68.
Sun Xiaoming, Yan Donghui, He Wei, Zhang Xingyao. 2015. Characteristics of ITS2 Secondary Structure of Marssonina brunnea Two Formae Speciales. Scientia Silvae Sinicae, 51(11): 60-68.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20151108
基于杨生褐盘二孢菌2个专化型的ITS2二级结构特征分析
孙晓明1, 严东辉1, 2, 贺伟3, 张星耀1, 2    
1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 国家林业局森林保护学重点实验室 北京 100091；
2. 南京林业大学南方现代林业协同创新中心 南京 210037；
收稿日期：2014-12-19；修回日期：2015-05-12
基金项目：国家自然科学基金项目(31370645); 引进国际先进林业科学技术项目(2013-4-10); 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目(CAFRIFEEP201415); 国家高技术研究发展计划项目(2012AA101501)。
通讯作者：严东辉
摘要：【目的】杨生褐盘二孢菌在杨属的不同寄主上存在2个专化型，根据形态特征和现有的一些核酸分子序列标记上不易区分；本文在利用盘二孢属核糖体转录间隔区(ITS)序列构建的系统发育树基础上，结合ITS2区分2个专化型的特异性。【方法】对23株杨生褐盘二孢菌孢子形态特征观察。以基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到ITS序列。对从NCBI数据库中下载的盘二孢属的参考ITS序列，分别利用最大似然法、最大简约法和贝叶斯法构建3种系统发育树。同时，结合应用The ITS2 database预测ITS2二级结构模型，从分子进化角度分析杨生褐盘二孢菌2个专化型的特性。【结果】在寄主叶片上挑取的病原菌孢子形态比较典型，而在培养基上培养的孢子形态差异较大，不能依据传统的芽管萌发数有效区分2个专化型。3种ITS序列系统发育树可区分盘二孢属的3个种，但无法将参考ITS序列准确定位到专化型中。通过比较盘二孢属ITS2二级结构发现：蔷薇盘二孢菌和苹果盘二孢菌种内的菌株以及包括参考ITS序列在内的杨生褐盘二孢菌同一专化型的ITS2二级结构模型完全相同，但3个种之间及杨生褐盘二孢菌2专化型之间，ITS2二级结构上有多个位点的碱基差异。其中，杨生褐盘二孢菌白杨专化型的ITS2二级结构中螺旋Ⅰ上第17位碱基为A，螺旋Ⅱ上第43和44位碱基为AC，螺旋Ⅲ的CBC位点上配对碱基是第76和114位碱基C和G，hemi-CBC位点上是第75位碱基U；黑杨专化型的ITS2二级结构中螺旋Ⅰ上第17位碱基为U，螺旋Ⅱ上第43和44位碱基分别为G和U，螺旋Ⅲ上CBC位点上配对碱基分别是第76和114位的碱基U和A，hemi-CBC位点上是第75位碱基C。杨生褐盘二孢菌2个专化型在这些结构上存在碱基变异。【结论】基于ITS序列构建的3种系统发育树能将盘二孢属真菌在种间水平上进行区分，但不能在种内区分；通过ITS2二级结构的比较可发现，盘二孢属内不同种和专化型的碱基存在明显差异，且种内专化型存在CBCs配对碱基差异。因此，ITS2二级结构和系统发育树是更有效地区分杨生褐盘二孢菌2个专化型的分子依据。
关键词： 杨生褐盘二孢菌    专化型    系统发育树    ITS2二级结构    CBC分析    
Characteristics of ITS2 Secondary Structure of Marssonina brunnea Two Formae Speciales
Sun Xiaoming1, Yan Donghui1, 2, He Wei3, Zhang Xingyao1, 2    
1. Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, CAF Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration Beijing 100091;
3. Beijing Forestry University Beijing 100083
Abstract: [Objective] Two formae speciales of Marssonina brunnea in Populus genus cannot be distinguished easily based on their morphologies and some nucleic acid molecular sequence marks. In this study, we applied combination of the phylogenetic trees with Marssonina ribosomal internal transcribed spacer(ITS)sequence and the secondary structures of ITS2 to discriminate the specificities of the two formae speciales. [Method] The twenty-three strains were cultured for fungal spore morphology observation. Genomic DNA was used as a template for PCR amplification on their ITS sequences. The reference ITS sequences of Marssonina were downloaded from the NCBI database.Three phylogenetic trees based on ML, MP and Bayes methods, respectively,were constructed.The ITS2 database was applied to predict ITS2 secondary structure model,and analyze the characterizations of the two formae speciales from the perspective of molecular evolution.[Result] The pathogen spore had a typical morphology of a forma specialis in host leaves in the field,but the spores were quite different in morphology on culture medium. We can't effectively distinguish two formae speciales on the basis of the traditional number of germinated germ tubes. Three kinds of ITS sequences phylogenetic trees according to ML, MP and Bayes approaches showed that there were three species in Marssonina genus. But reference ITS sequences with a formae speciales from M. brunnea can't be accurately located into the other same formae speciales with other strains. With the ITS2 secondary structure prediction model, it was found that Marssonina ITS2 secondary structure was identical in the three species, M. rosae, M. coronariae, and two formae speciales of M. brunnea. But the ITS2 secondary structures have multiple bases sites different among the three species. In the ITS2 secondary structure of M. brunnea leuce biotypes, the 17th base is A in Helix I, the 43th and 44th bases are AC in Helix Ⅱ. The compensatory base change(CBC) sites are the 76th C and 114th G, hemi-CBC site is the 75th U in Helix Ⅲ. In the ITS2 secondary structure of M. brunnea aigeiros biotypes, the 17th base is U in Helix I, the 43th and 44th bases are GU in Helix Ⅱ. The compensatory base change(CBC) sites are 76th U and 114th A, hemi-CBC site is the 75th C in Helix Ⅲ. These base changes are distinguished in two formae speciales in the ITS2 secondary structure.[Conclusion] The Marssonina strains can be distinguished in species level by three phylogenetic trees base on ITS sequences, but cannot be distinguished into subspecies; With comparative analysis of ITS2 secondary structures, the Marssonina genus is obviously different, and there are also compensatory base changes within formae speciales. Application of ITS2 secondary structures combined with phylogenetic trees can be more effective molecular characterizations to distinguish the two formae speciales in M. brunnea.
Key words: Marssonina brunnea    forma specialis    phylogenetic tree    the secondary structure of the ITS2    CBC analysis    

杨生褐盘二孢菌[(Marssonina brunne(Ell.et Ev.)Magn.]是杨树叶部的专性致病菌，引起杨树黑斑病，在我国有广泛的分布，造成林业经济损失(李传道，1984;韩正敏等，1998;Zhu et al., 2012)。杨生褐盘二孢菌在杨树上存在不同专化型(李传道，1984;贺伟等，1991;韩正敏等，1998;Han et al., 2000;梁伟红等，2006)，在侵染过程中根据其寄主派系和孢子萌发时的芽管数不同分为多芽管专化型(Marssonina brunnea f.sp.multigermtubi)和单芽管专化型(Marssonina brunnea f.sp.monogermtubi)。多芽管专化型主要寄生在黑杨派(Section Aigeiros)和青杨派(Section Tacamahaca)杨树上，孢子萌发时有1~5个芽管，多为2~3个;单芽管专化型主要寄生在白杨派(Section Leuce)杨树上，孢子萌发时仅有1个芽管。杨生褐盘二孢菌2个专化型的划分适合我国的大多数地区(贺伟等，1991;韩正敏等，1998;Han et al., 2000)。在人工培养条件下(韩正敏等，1998;Han et al., 2000)，分离自白杨派杨树上的菌株在PDA培养基上菌落呈深褐色，并产生酱红色的孢子堆;来自黑杨派和青杨派上的菌株在PDA培养基上菌落灰色，产生黄绿色孢子堆。在培养基表面洗下真菌孢子，制取孢子悬浮液接种到杨树叶片，结果发现白杨派专化型菌株只能使白杨品种致病，黑杨派专化型菌株只能引起黑杨或青杨品种致病。笔者在培养基培养条件下发现，杨生褐盘二孢菌生长缓慢，菌株单个分生孢子形态变异幅度较大，以芽管的萌发数区分并不明显，其专化型在培养性状上难以区分;而在接种寄主后，在叶组织上产生的孢子萌发芽管数与前人的研究结果相同，即单芽管和多芽管的区分。

利用分子手段鉴定物种种类已经应用非常广泛，CO1、ITS、LSU、RPB1等分子标记在真菌上有着很多的应用(Schoch et al., 2012)。与其他区域的分子标记相比，核糖体内部转录间隔区(ITS)由于PCR扩增成功率高、在种水平鉴定类别、技术简便等优点在真菌的种类鉴定上被用来作为主要参考区域(Kress et al., 2005; Seifert et al., 2009; Hollingsworth，2011;Schoch et al., 2012)。ITS也可以为一些真菌提供判别遗传距离差异程度的指标，在系统发育方法识别真菌的系统分类单元也时常有效。使用ITS研究系统发育关系已经有庞大的数据支撑。利用ITS鉴定杨生褐盘二孢菌时发现，2专化型存在碱基信息的差异，但是这些碱基信息并不足以将2个同源的分类单元很好地区分。与基本的核苷酸序列相比，二级结构是最好的辅助系统分类特征，有助于提高系统发育的识别能力(Kruger et al., 2008)。ITS2虽然其长度和序列是多种多样的，但是它的二级结构中有高度保守的核心结构(Coleman et al., 2003; Schultz et al., 2005)，同时二级结构也增加了分类学特征和亲缘分辨能力(Kruger et al., 2008)。配对碱基变化(compensatory base changes，CBC)分析是利用二级结构中配对碱基的变化来分析遗传距离很近菌株的差异，在昆虫及植物上都能很好地区分种属关系(Koetschan et al., 2010; Ruhl et al., 2010; Caisová et al.， 2011)，这使ITS2二级结构在物种种类鉴别上的应用越来越受到人们的关注。

笔者对分离得到的23株杨生褐盘二孢菌进行测序，获得ITS序列，并与NCBI数据库中盘二孢属的ITS序列合并，构建系统发育树，预测ITS2二级结构模型，从分子进化角度分析杨生褐盘二孢菌2个专化型的区别，为真菌的种内专化型的鉴定提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试菌株获取

于2013年5-10月分别在河北任丘(115°56′-116°26′E，38°33′-38°57′N)、北京海淀(116°03′-116°23′E，39°53′-40°09′N)进行杨树黑斑病发生情况调查，观察黑斑病的发病时期及危害状况。调查的杨树品种有:107杨(Populus euramericana cv. 74/76)、欧洲黑杨(P.nigra)、毛白杨(P.tomentosa)(表 1)。

表 1 杨树叶片上分离得到杨生褐盘二孢菌供试样本 Tab.1 The samples of Marssonina brunnea from popular leaves

采集样本材料进行组织分离，获取黑斑病菌株。采取刚刚发病的植物组织材料，用无菌的褐色信封包装后带回实验室，先把杨树叶片用无菌水冲洗晾干后，直接用消毒的剪刀剪去带有病斑的组织，将剪好的组织片(3 mm×3 mm)先用75%乙醇消毒1次，然后用3%次氯酸钠消毒2 min，最后用无菌水洗涤3次，接种到PDA抗性培养基上，培养基灭菌后加入硫酸链霉素(50 μg·mL-1)以抑制细菌生长。保证一次性培养皿中有一定的湿度，待病斑上长出白色分生孢子角后挑取分生孢子到新的培养皿中培养。

1.2 杨生褐盘二孢专化性孢子形态基础

用分离得到的菌株配制孢子悬浮液，浓度稀释为103个·mL-1后均匀涂抹到PDA平板上。在25 ℃黑暗条件下培养，每隔2天在解剖镜下观察培养皿中孢子的生长状况，并挑取菌丝在显微镜下观察是否产孢。将孢子接种到寄主叶片上，待产生病斑后，挑取分生孢子角配制孢子悬浮液浓度为105个·mL-1，用移液器滴加50~70 μL孢子悬浮液至盖玻片上，将凹玻片凹槽周围湿润，盖玻片倒置在凹玻片下，放到湿润的培养皿中，在25 ℃黑暗条件下培养。将光学显微镜(OLMYMPUS BX51)及设备OLMYMPUS DP72连接至计算机终端，利用软件cellScns Entry 1.5在计算机上观察测量10个孢子的大小及100个孢子的芽管萌发情况，试验重复3次。

1.3 ITS序列的获取

先利用CTAB法提取病原菌DNA，然后利用真菌引物ITS1/ITS4(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增核糖体内部转录间隔区ITS1-5.8S-ITS2序列(White et al., 1990)。普通PCR扩增体系为25 μL[PCR Mix12.5 μL(博迈德)，引物ITS1/ITS4各1 μL，DNA模板1 μL，加ddH2O 9.5 μL]。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，33个循环;最后延伸5 min。凝胶电泳检测PCR结果:取3.5 μL PCR原液样品，加入2~3 μL 6×Loading buffer，以DNA MarkerⅡ为分子量标准，在1%的琼脂胶中电泳35 min，观察电泳结果。将PCR产物测序(三博远志公司)，测序所得结果通过拼接比对校准后，在GenBank中Blast，进行序列的同源性比较。

1.4 系统发育分析及ITS2二级结构模型

测序获得的序列经过Bioedit 7.0和DNAMAN6.0比对拼接，去除错误碱基。使用软件sequin整理序列信息后提交到GenBank，获得登录号KM246325-KM246347，KP099198，KP099199(表 1)。从GenBank中下载参考菌株ITS序列(表 2)。其中，Pezicula eucrita作为发育树的外群，ITS的GenBank登录号AF141194.1。序列比对使用MAFFT version 7(Katoh et al., 2002)，根据Modeltest 3.7中的AIC准则构建系统发育树的模型，系统发育关系的推断采用最大似然法(ML)、贝叶斯法(BI)和最大简约法(MP)。通过RaxML(Stamatakis et al., 2008)构建盘二孢属ITS的ML系统发育树，BI系统发育树分析利用MrBayes3.2.2(Ronquist et al., 2003)，MP系统发育树的构建利用PAUP4.0，3种方法均采用自距检验估计所构建系统树的置信度，重复检验次数均为1 000。

表 2 GenBank下载盘二孢属真菌ITS序列信息 Tab.2 The ITS datea of Marssonina spp. from GenBank

ITS2序列的获取是在The ITS2 database上，首先利用Hidden Markov Model(HMM)在ITS序列中对ITS2的位置进行注释(Annotate tab)，其中几个相关的参数分别是： “fungi/ Maximum E-value < 0.01/ Minimum size of ITS2 100 or 150”，ITS2二级结构被限定在5.8S和28S之间。通过完整的数据同源性建模预测二级结构(Predict tab)，除了可预测整体结构，在螺旋Ⅲ顶端具有的保守结构如“UGGU”和在第2个螺旋上的U-U mismatch也可以被定位(Motif tab)(Koetschan et al., 2010)。将获得的ITS2和模型输入到软件4SALE中，对ITS2二级结构进行CBC分析，同时利用该软件对图形进行编辑(Seibel et al., 2006; 2008)。

1.5 统计方法

试验中孢子形态观察的相关统计数据处理均使用统计软件SPSS(17.0)，采用单样本T检验差异显著性(P < 0.05)。

2 结果与分析 2.1 专化型菌株的形态基础

从毛白杨上分离得到白杨专化型15株，欧洲黑杨和107杨上分离得到专化型8株(表 1)。2种专化型在PDA培养基上培养时显示:初期2种专化型菌株均为白色，2周后黑杨专化性菌株菌丝颜色逐渐加深，变为灰色直至黑色，其分生孢子为灰色，单孢形成菌落在第9天产生新的孢子;白杨专化型菌落颜色逐渐变为褐色最后变为黑色，其分生孢子堆为深褐色晶体状，单胞形成的菌落在培养第7天观察到新产生的孢子;黑杨专化型菌株和白杨专化型菌株相同专化型之间孢子形态上没有显著差异，黑杨专化型孢子大小平均为(14.59±0.76)μm×(6.94 ±0.3)μm，白杨专化型孢子大小平均为(20.23±0.86)μm×(7.25±0.43)μm;孢子在无菌水中萌发时绝大多数为1个芽管，在无菌水中24 h孢子的萌发率，黑杨专化型为38%±1.5%，白杨专化型为22%±5.8%。但是，当接种到对应寄主品种上发病后，从叶组织上直接挑取的分生孢子在无菌水中萌发时显示:黑杨专化型有2~3个芽管，24 h孢子萌发率为66.7%±6.8%，多个芽管的萌发率为23%±5.5%，而白杨专化型只有1个芽管，在无菌水中24 h的萌发率为96.1%±0.6%;黑杨专化型孢子大小平均为(16.53±0.8)μm×(7.4±0.38)μm，白杨专化型孢子大小平均为(15.22± 0.41)μm×(5.74±0.26)μm。此时孢子大小形态变得比较规整，而在培养基上培养的孢子形态差异较大(图 1)。

图 1 杨生褐盘二孢菌菌株及孢子在PDA培养基上和寄主叶片上的形态 Fig. 1 The morphology of Marssonina brunnea on PDA and host leaf a.培养基上黑杨专化型菌株 Aigeiros biotype strains on PDA; b.黑杨专化型菌株培养基上洗下的孢子Spores washed from aigeiros biotype on PDA; c.接种后黑杨派叶片上的病斑Symptoms of infected aigeiros leaf; d.接种后黑杨派叶片上挑取的孢子Spores from infected aigeiros leaf； e.培养基上白杨专化型菌株Leuce biotypes strain on PDA; f. 白杨专化型菌株培养基上洗下的孢子Spores washed from leuce biotype on PDA; g.接种后白杨派叶片上的病斑Symptoms of infected leuce leaf; h.接种白杨派叶片上挑取的孢子Spores from infected leuce leaf. Sp:孢子Spore;Tu:芽管Tube;Ac:分生孢子堆Acervulus.
2.2 ITS系统发育树分析

利用盘二孢属菌株的ITS序列构建系统发育树，以其同科的菌株Pezicula eucrita(CBS662.6)作为系统发育树的外群，基于ML，BI，MP分别构建系统发育树(图 2)，其中最小自举值58在ML树上。系统发育树共有 4个分支，其中1，2分别是盘二孢属的苹果盘二孢菌和蔷薇盘二孢菌的发育树分支，3，4表示试验所分离出的杨生褐盘二孢菌菌株的发育树分支。林业微生物菌库获取的菌株H2，M1，M2分别在其对应的分支内。这3种系统发育树的拓扑结构在4分支上存在差异，菌株H2与JN172909.1均来自黑杨，但是在3种系统发育树中它们却独立分支，且在MP树和Br树中这两条序列归类到黑杨专化型类群中，但在ML树它们却被归类到白杨专化型类群中(图 2)。

图 2 基于rRNA-ITS基因序列构建的盘二孢属系统发育树 Fig. 2 Marssonina spp. phylogenetic tree based on rRNA-ITS gene sequences data 节点上的数字分别对应ML/ BI/ MP树和它们自举值(1 000次重复) Numbers at node are bootstrap values (1 000 replicates) from ML/BI/MP method, respectively.
2.3 ITS2二级结构分析

经过在The ITS2 database网页上的处理，获得杨生褐盘二孢菌株的ITS2二级结构的预测。杨生褐盘二孢菌及盘二孢属菌株ITS2二级结构均包含4个螺旋结构； 螺旋Ⅲ的5′-顶部有保守基元(motif)，第2个螺旋包含嘧啶错配(U-Umismatch)。其中，杨生褐盘二孢菌ITS2二级结构包含152个碱基，保守基元位于第85—99个碱基之间，错配位于第22—36个碱基与第53—67个碱基之间(图 3)。其二级结构预测模型中，相同专化型菌株之间的ITS2二级结构模型完全相同。以白杨专化型(B)为本底，比较其与黑杨专化型(H)、M2和M1二级结构的碱基差异如表 3所示，2专化型在螺旋Ⅲ上有1个CBC和1个hemi-CBC。同属的ITS2的二级结构预测模型上，M2与B比较，有6个CBCs和2个hemi-CBCs，M1与B相比，有6个CBCs和1个hemi-CBC。

图 3 杨生褐盘二孢2专化型ITS2序列及二级结构模型 Fig. 3 ITS2 sequences and secondary structure model of M. brunnea two forma specialis strains H.黑杨专化型菌株Aigeiros biotypes strain;B白杨专化型菌株Leuce biotypes strain;CK:GenBank No.为JN172909.1 的参考序列Sequence of JN172909;M1.苹果盘二孢菌株M.coronariae strain;M2.蔷薇盘二孢菌株M.rosae strain.
表 3 盘二孢属ITS2二级结构数据 Tab.3 ITS2 secondary structure data of Marssonina sp.
3 结论与讨论

杨树黑斑病是杨属植物叶部的专性病害，利用其在培养条件下的孢子形态并不能很好地区分2个专化型菌株。应用ITS序列在真菌的种间及属间的鉴定和分子检测上已经取得了显著的成果。Zhu等(2012)利用序列JN172909.1和相近属种的ITS序列构建系统NJ树，证明苹果盘二孢菌、蔷薇盘二孢菌和杨生褐盘二孢菌属于相邻近的3个姐妹群。本文也利用3种系统发育树说明这3个种的种间关系，但是系统发育树未能很好地反映不同的专化型分支菌株，H2序列与参考菌株JN172909.1序列在3种系统发育树分支上存在差异，这2个菌株与现有的试验菌株来源和分离时间均不相同，仅仅依靠ITS序列的基本核苷酸信息，不能将二者定位到2个专化型中。

ITS转录间隔区ITS2序列的二级结构包含更加丰富的信息，可以为种内专化型鉴定提供依据。ITS2二级结构在rRNA加工成熟过程中，经历2类模型即螺旋模型(helices model)和指环模型(ring model)(CÔTÉ et al.， 2002)。Schultz等(2005)认为ITS2二级结构的核心结构具有以下特征:1)4个螺旋;2)螺旋Ⅲ最长;3)螺旋Ⅲ的5′-顶部有保守的"UGGU "基元(motif)或其相似的基元" UGGGU "，" GGU "以及" UGG";4)第2个螺旋包含嘧啶错配(U-Umismatch)。这些保守核心结构在真核生物上通用并用来比较相近种的关系。Coleman等(2007)认为ITS2二级结构中螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ对rRNA基因的加工至关重要。其中，在螺旋Ⅲ上，CBCs指发生在配对结构位置的碱基均发生改变，改变后的碱基保留配对，CBCS经常用来分析密切相关物种的区别;与CBCs相对应的是hemi-CBCs，指配对碱基中的一个碱基发生改变，且仍然维持配对(Ruhl et al., 2010)。一般2个ITS2二级结构比较时，如存在1个以上CBCs，表明有很大可能来自2个物种(Koetschan et al., 2010)。本研究通过比较盘二孢属菌株的ITS2二级结构发现:杨生褐盘二孢菌白杨专化型的ITS2二级结构中，螺旋Ⅰ上第17位碱基为A，螺旋Ⅱ上第43和44位碱基分别为A，C，螺旋Ⅲ上CBC位点的配对碱基是第76位的C和第114位的G，hemi-CBC位点上则是第75位碱基U;黑杨专化型的ITS2二级结构中，螺旋Ⅰ上第17位碱基为U，螺旋Ⅱ上第43和44位碱基分别为G，U，螺旋Ⅲ上CBC位点上配对碱基分别是第76和114位的U和A，hemi-CBC位点上是第75位碱基C，这些结构上存在的碱基变异是区分杨生褐盘二孢菌2个专化型的主要依据。对杨生褐盘二孢2个专化型菌株及其他来源的参考菌株ITS2二级结构进行比较发现，在保守基元和错配区内也存在碱基位点的变化，其中2个参考序列与白杨专化型(B)在螺旋Ⅰ和螺旋Ⅱ上的碱基差异位点以及在螺旋Ⅲ上存在的1个CBC和1个hemi-CBC，这些特征与黑杨专化型(H)相同，说明这2个参考菌株属于黑杨专化型。参考序列与黑杨专化型(H)结构上的保守基元和螺旋Ⅳ上存在相同碱基位点差异，由此可以推测在ITS2二级结构上保守基元和螺旋Ⅳ表现出一定的系统进化关系。杨生褐盘二孢菌的ITS2二级模型与蔷薇盘二孢菌、苹果盘二孢菌的碱基数目和CBCs均有较大差异。通过ITS2二级结构分析发现:白杨专化型和黑杨专化型在结构上存在固定位点的碱基差异，这些差异是准确区分2个专化型的直接依据。

虽然ITS2二级结构能区分开杨生褐盘二孢菌的2个专化型，但是对于决定专化型的因素即控制不同芽管数量的因素或基因，现在还不明确，ITS2二级结构与控制因素或基因的联系也不清楚，需要进一步研究。

参考文献(References)
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