油桐(Vernicia fordii)是我国特有的亚热带地区代表性经济树种，也是重要的工业油料树种，新近人们又认识到油桐在生物能源方面具有重要开发利用价值。对于油桐的丰产栽培、油脂合成、生物柴油制备等已进行了较多的研究(Brown et al.，2005; Steven，2010; Shang et al.，2002; 孙汉洲等，2010; 谭晓风，2006; 张玲玲等，2011; 孙颖等，2007; 龚榜初等，1996; 黄福长，2011; 曹建琦，1987; 黄坤等，2008; 朱世永等，1992; 玄伟东等，2007; 周燕君等，2008)。油桐具有童期短、早花早实等重要生物学特性，一般播种后3年便开花(故又名"三年桐")，其中，'对年桐’品种播种后翌年即开花; 同时，油桐核基因组较小、自然变异丰富、性状分化强烈、对环境反应敏感，具有成为"经济林模式植物"的潜力(李建安等，2008)。探明油桐成花分子机制将为油桐及其他果用经济林树种花期调控和分子育种提供重要基础，然而，受研究材料和研究手段所限，目前对油桐花发育基因调控途径及早花分子机制的研究尚不深入。近年新兴的高通量测序技术(Illumina测序技术)具有数据量大、准确性好、灵敏度高、运行成本低等优点(Chen et al.，2012; Tuskan et al.，2006; Wilhelm et al.，2009)，已在很多木本植物如红豆杉(Taxus chinensis)(Hao et al.，2011)、橡胶树(Hevea brasiliensis)(Li et al.，2012)和茶树(Camellia sinensis)(Shi et al.，2011)等转录组测序研究中应用，能够从整体水平了解植物在特定阶段的基因表达模式和功能，从而更加便利地揭示特定生物学过程的分子机制(祁云霞等，2011)。本文利用Illumina测序技术对油桐品种'对年桐’2个花芽分化时期进行转录组测序，以期在转录水平上大规模发掘油桐开花相关基因，为阐明油桐成花分子机制提供部分依据。

供试材料为7年生油桐品种'对年桐’实生株花芽，样本采自中南林业科技大学，采集时间为8月、10月，分别处于花芽分化中期和末期。

采用改良的CTAB+OMEGA RNA提取试剂盒提取，委托深圳华大基因公司采用Illumina HiSeq^TM2000测序仪对油桐花芽样本进行转录组测序。

参照Jiang等(2013)转录组数据的分析方法对测序数据进行原始数据处理、序列组装、功能注释、Pathway富集性分析、差异分析等。利用在线微卫星位点扫描工具SSRIT在转录组数据中查找SSR位点，查找标准位二、三、四、五、六核苷酸的最小重复次数分别为 9，7，5，5，5 次，并且 SSR 位点侧翼序列长度≥50 bp。

对油桐8月(Ⅰ期)、10月(Ⅱ期)的花芽转录组测序后总共获得70 511条unigene序列，其中Ⅰ期和Ⅱ期分别获得59 270条和65 481条序列(图 1)。unigene序列长度主要分布在300 ~3 000 nt之间，长度大于3 000 nt的序列数量有1 549条，占总序列数量的2.2%。unigene序列数量随着序列长度的增加而平缓逐步递减，可见测试样品质量很好。

	图 1 Unigene序列长度分布 Fig. 1 The length distribution of unigene sequence

图 2 所示，GO富集性分析将注释的unigene序列分成分子功能、细胞组分、生物过程3个大类55个小类。其中细胞增殖、代谢过程、催化活性3类富集程度较高，这可能与花芽分化过程中分生组织不断进行细胞增殖来建成各种花器官原基，导致花芽内代谢活动旺盛有关。unigene的Pathway富集性分析将unigene归类于128个代谢途径，其中花芽分化Ⅰ期和Ⅱ期差异unigene的Pathway富集性分析的前10个Pathway数据列于表 1。对油桐花芽2个发育时期的unigene表达量进行比较后发现，随着花芽的发育，越来越多的unigene表达量呈上调趋势且上调基因数超过下调基因数(图 3)。

图 2 Unigene的GO功能注释及分类统计结果 Fig. 2 GO function annotation and classification of unigene 1) 生物过程 1:生物附着; 2:生物调控; 3:碳利用; 4:细胞增殖; 5:细胞成分组织; 6:细胞过程; 7:凋亡; 8:发育过程; 9:定位系统的建立; 10:生长; 11:免疫系统过程; 12:定位; 13:移动; 14:代谢过程; 15:多机体过程; 16:多细胞组织过程; 17:生物过程负调控; 18:生物过程正调控; 19:生物过程调控; 20:再生; 21:再生过程; 22:刺激应答; 23:信号; 24:单一的生物过程。2)细胞成分 25:细胞; 26:胞间连丝; 27:细胞要素; 28:细胞外液; 29:细胞外液要素; 30:细胞间区域; 31:细胞间区域要素; 32:大分子复合物; 33:膜; 34:膜要素; 35:膜结合腔体; 36:核状体; 37:细胞器; 38:细胞器要素; 39:共质体。 3)分子功能 40:抗氧化剂活性; 41:结合剂活性; 42:催化剂活性; 43:通道调节因子活性; 44:电荷载体活性; 45:酶调控因子活性; 46:金属伴侣活性; 47:分子感应器活性; 48:核苷酸结合转录因子活性; 49:营养受体活性; 50:蛋白质结合转录因子活性; 51:蛋白标签; 52:受体活性; 53:结构分子活性; 54:翻译调控因子活性; 55:转运因子活性。 1) Biological process 1: Biological adhesion; 2:Biological regulation; 3:Carbon utilization; 4:Cell proliferation; 5:Cellular component organization or biogenesis; 6:Cellular process; 7:Death; 8:Developmental process; 9:Establishment of localization; 10:Growth; 11:Immune system process; 12:Localization; 13:Locomotion; 14:Metabolic process; 15:Multi-organism process; 16:Multicellular organismal process; 17:Negative regulation of biological process; 18:Positive regulation of biological process; 19:Regulation of biological process; 20:Reproduction; 21:Reproductive process; 22:Response to stimulus; 23:Signaling; 24:Single-organism process. 2) Cellular component 25:Cell; 26:Cell junction; 27:Cell part; 28:Extracellular matrix; 29:Extracellular matrix part; 30:Extracellular region; 31:Extracellular region part; 32:Macromolecular complex; 33:Membrane; 34:Membrane part; 35:Membrane-enclosed lumen; 36:Nucleoid; 37:Organelle; 38:Organelle part; 39:Symplast. 3) Molecular function 40:Antioxidant activity; 41:Binding; 42:Catalytic activity; 43:Channel regulator activity; 44:Electron carrier activity; 45:Enzyme regulator activity; 46:Metallochaperone activity; 47:Molecular transducer activity; 48:Nucleic acid binding transcription factor activity; 49:Nutrient reservoir activity; 50:Protein binding transcription factor activity; 51:Protein tag; 52:Receptor activity; 53:Structural molecule activity; 54:Translation regulator activity; 55:Transporter activity.

表 1 转录组KEGG代谢途径分类 Tab.1 KEGG classification of transcriptome

表 1 转录组KEGG代谢途径分类 Tab.1 KEGG classification of transcriptome 编号No. 代谢通路Pathway DEG数量DEG number 总数量Number 1 植物激素信号转导Plant hormone signal transduction 694 1 255 2 二芳基庚和姜辣素的生物合成Stilbenoid, diarylheptanoid and gingerol biosynthesis 206 300 3 次生代谢产物生物合成Biosynthesis of secondary metabolites 1 484 3 063 4 柠檬烯和α-蒎烯降解Limonene and pinene degradation 166 251 5 植物-真菌互作Plant-pathogen interaction 836 1 680 6 类黄酮生物合成Flavonoid biosynthesis 179 280 7 苯丙烷生物合成Phenylpropanoid biosynthesis 263 465 8 双萜生物合成Diterpenoid biosynthesis 90 130 9 淀粉和蔗糖代谢Starch and sucrose metabolism 325 614 10 新陈代谢Metabolic pathways 2 558 5 856

	图 3 差异表达基因数 Fig. 3 Number of different expressed unigene

利用在线微卫星位点扫描工具SSRIT在转录组数据中查找到2 020个由二至六个核苷酸重复序列组成的SSR位点(表 2)，占unigene总数的比例为3.41%。二核苷酸重复类型所占比例最高，达到60.04%，随后依次为三、四、五、六核苷酸重复类型，所占比例分别为 30.10%，7.97%，1.00%，0.89%。在检出的SSR中，共发现381种基元类型，出现频率高的前10种重复基元为AC/GT(854个)，AT/AT(278个)，AAG/CTT(151个)，AAT/ATT(118个)，ACC/GGT(91个)，AC/GT(81个)，ATC/ATG(72个)，AGG/CCT(63个)，AGC/CTG(49个)，AAC/GTT(32个)。上述SSR 特征分析有助于开展油桐及其同属物种通用性分子标记开发和遗传图谱构建的研究。

表 2 SSR不同重复基元分布及优势碱基组成 Tab.2 Distribution and compositions of the dominant repeat for the different SSR

表 2 SSR不同重复基元分布及优势碱基组成 Tab.2 Distribution and compositions of the dominant repeat for the different SSR 重复类型Repeat type SSR数量SSR number 比例Proportion(%) 优势重复单元Advantage repeat 二核苷酸Dinucleotide 1 213 60.04 AG/CT 三核苷酸Trinucleotide 608 30.10 AAG/CTT 四核苷酸Tetranucleotide 161 7.97 AAAC/GTTT 五核苷酸Pentanucleotide 20 1.00 AAAAG/CTTTT 六核苷酸Hexanucleotide 18 0.89 AGAGGG/CCCTCT 总计Total 2 020 100.0

大量研究表明，显花植物花发育具有相对遗传保守性。本研究从油桐花芽转录组数据中获得103个开花相关基因，其中包括光周期途径相关基因如光敏色素基因PHYA，PHYB，PHYC和PHYE，隐花色素基因CRY1和CRY2，生物节律相关基因如CO，ELF4和PIF1等，春化途径相关基因如FLC，VIN3，VRN1，VRN2LEO1和ACT1等，GA途径相关基因如GAI，RGL1和DELLA1等，自主途径相关基因如FCA，FLD和LD等。此外，从转录组数据中还获得了FRI，FES1和FRL1这3个与FRI依赖途径相关的调控基因以及与年龄调节相关的SPL基因。

光周期调控途径中，光敏色素PHYA，PHYB，PHYC，PHYD和隐花色素基因 CRY1，CRY2均为下调表达基因，而CDF2，PIF3，LHY，ZTL，ELF3等基因则为该调控途径上调表达基因。与植物昼夜节律相关的CCA1基因上调表达。春化途径中的上调基因有VIP2，VRN1。属于赤霉素成花调控途径的RGL基因为上调基因而GAI基因属于下调基因。自主调控途径基因全部为上调表达基因。整合子基因中上调表达基因FLC，AP1，SOC1。与花器官发育相关基因属于上调表达基因。编码CO基因的36个unigene中有14个下调表达，22个上调表达。

本研究转录组测序样品为处于形态分化阶段2个不同时期的油桐花芽，是油桐成花转变的典型时期。研究结果在一定程度上解析了油桐花芽形态分化的分子调控模式与机制，并为进一步的花发育分子机制研究提供了基础，也为油桐花期调控和分子育种提供了可利用的基因资源。

植物通过叶片感受光诱导，经过一系列生理生化反应传导到茎尖生长点，从而诱导成花。本研究发掘出在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦(Triticum aestivum)、甘菊(Dendranthema lav and ulifolium)中均有发现的一系列受体基因，如光敏色素基因PHYA等，由此可见其进化遗传的保守性。本研究发掘出12条GI基因同源序列，有研究表明，GI基因通过感受昼夜节律变化，进而引起自身表达量变化，从而调控下游CO基因的表达模式，最终影响植物的成花时间; 本研究发现36条CO基因的同源序列，在长日照的傍晚和短日照的晚上这2种光照条件下，当CO基因的表达量超过一定数值后激活FT基因表达，从而促使植物开花(孙昌辉等，2007)。也有研究表明，CO在光周期调控途径中的作用与物种有关(Hayama et al.，2003)，因此该基因在油桐花芽分化中的作用机制还有待进一步研究。

光周期途径和赤霉素途径最终通过激活开花整合基因FT和SOC1促进植物开花(Samach et al.，2000; Suarez et al.，2001)。在油桐花芽转录组中发现5条与FT高度同源的unigene序列(Izawa et al.，2002; Kojima et al.，2002)。SOC1基因能够被长日照条件下的CO激活或GA途径激活(Lee et al.，2010)，本研究在油桐转录组中发现4条与之高度相似的unigene序列。花芽分化Ⅱ期光敏色素基因和隐花色素基因表达量上调，昼夜节律钟基因CCA1的表达量也上调，另外，ELF4的表达量下降，PIF3的表达量升高，这表明此时油桐光周期途径被启动。

油桐在春季自然开花，需要春化作用的诱导。本研究发掘出需受长期低温诱导才能在春化初期表达的VIN3基因，但没有发掘到与春化稳定作用相关的VIN1基因和VIN2基因，可见其春化机制与拟南芥存在差异。同时鉴定出与小麦的春化相关基因VRN1和VRN2同源序列分别为16条和2条，表明油桐春化机制可能有2条或更多条途径调控。

春化途径、自主途径和FRI依赖途径均通过不同方式调控FLC基因表达，从而影响植物成花。春化作用可降低FLC的表达水平而促进植物开花，FRI基因与春化作用相拮抗，从而对FLC的表达水平起正调控作用。自主途径的一系列基因则对FLC的表达起负调控作用。本研究发掘出与上述3类调控途径基因如FCA，FY，FLD，FPA，LD等高度同源的若干unigene序列。另外，还发现HOS1基因的同源unigene序列，HOS1基因独立于上述3条成花调控途径，负调控FLC基因的表达。转录组数据中发现了与年龄调控途径相关SPL基因的同源序列。以上分析表明油桐具有复杂的成花调控途径，其调控机制的解析有待于进一步研究。

春化途径和自主途径都是通过抑制FLC基因的表达来参与成花调控(Amasino et al.，2010; Kim et al.，2009)。本研究鉴定出2条与FLC基因高度同源的unigene序列，大多数拟南芥天然早花突变体的FLC基因表达较弱或者不表达。FLC基因在拟南芥和其他物种中的功能存在差异(Locasdo et al.，2009)，FLC基因在油桐中的表达模式与功能是否与拟南芥相同还有待研究。