油松(Pinus tabulaeformis)是我国特有的针叶树种，木材坚实，富含松脂，耐腐朽，是优良的建筑、电杆、枕木、矿柱等用材。油松是北方的主要造林树种之一，它分布广，适应性强，根系发达，树姿雄伟，枝叶繁茂，有良好的保持水土和美化环境的功能(徐化成，1993)。近期关于油松的研究主要有油松林水分平衡(常建国等，2013)、球花与花粉管(钮世辉等，2013; 尚峰男等，2013)、光照对幼苗的影响(冯晓燕等，2013)、人工林更新(李兵兵等，2012)和种子萌芽呼吸代谢(陈丽培等，2012)等方面。但是，在生产中，油松良种造林经常受到良种苗数量的限制，通过组织培养扩繁有限的良种是解决该问题的重要途径之一(齐力旺等，1995; 郑均宝等，1996; 张冬梅等，2004; 谢斌等，2007)。

植物组织培养植株再生常见的途径有直接器官发生和体细胞发生。松属(Pinus)器官发生和体细胞发生繁殖已经取得了很大的进展。在过去的20多年中，松属树种的体细胞胚胎发生的研究发展很快(Becw et al.，1990; 郑均宝等，1996; Percy et al.，2000; Park et al.，2006; Carneros et al.，2009)，但是，培养基改善(Le-Feuvre et al.，2013)、体细胞胚成熟和萌芽(Montalbán et al.，2010)、体细胞组织保存(Kong et al.，2011)等方面的技术难题在松属树种中尚未解决。

直接器官发生在很多松属树种中都已成功实现(Gonzzalez et al.，1998; Parasharami et al.，2003; Tang et al.，2005; 朱丽华等，2006; Cortizo et al.，2009)，但是，生根难是针叶树组织培养中的一大难题，该问题一直是松属树种组织培养中研究的重点(Dumas et al.，1995; 董丽芬等，2006; Alonsoa et al.，2006; 李科友等，2008; 彭丽萍等，2008; Álvarez et al.，2009; 孔冬梅等，2010; Montalbán et al.，2011)。不定芽生根率低的问题影响油松组织培养快繁的实现，研究人员对影响油松组织培养不定芽生根的多方面因素进行了研究，如诱导根的培养基(孔冬梅等，2010)，外植体、培养基中外源激素(郑均宝等，1996; 孔冬梅等，2010)，培养基中的大量元素(董丽芬等，2006; 买凯乐等，2007)等，但是，生根率仍然不能达到生产要求。不定芽生根与不定芽生长情况有密切关系。因此，本研究通过对比油松不定芽苗态、丛芽块的切分方法、培养时间、芽长度、丛芽块的直径、鲜质量等对不定芽生根的影响，以期能定量地确定油松组织培养中生根诱导前期的不定芽培养时间和培养规格，进而提高油松试管苗的生根率。

油松种子采自陕西陇县八渡林场油松种子园。在5 ℃冰箱里沙藏4周。取油松成熟合子胚为外植体。

1)试验材料培养用0.1% KMnO₄溶液对油松种皮消毒20~30 min，去掉种皮后，用70%的酒精消毒40 s，再用0.1% HgCl₂消毒5.5~6 min，无菌水冲洗5 次，于无菌条件下剥取种胚，水平接种于改良的芽诱导培养基1/2MS+1.0 mg·L^-16-BA中，每瓶中放1 个种胚，培养8周。然后，继代到增殖壮苗培养基上(1/2MS+1.0 mg·L^-1KT+0.5 mg·L^-1NAA+0.1%AC)，进行不定芽的增殖壮苗培养。

外植体的各种处理均在无菌条件下进行。处理均为10 个外植体，重复6 次。培养温度为(25±2)℃，每日充分光照14 h，光照强度为2 500~3 000 lx。培养室相对湿度60%~80%。

2)不定芽丛芽块切分处理试验选出直径(试验中测量的丛芽块直径为芽块基部纵横平均直径)在1.5~2.0 cm范围内的不定芽丛芽块。对油松不定芽丛芽块分 2，3，4，5块切分处理，各处理所选不定芽丛芽块为10 块，重复3 次，切块方法为垂直芽块近似平均切分。30 天后对处理不定芽块生长状况进行统计。

3)生根培养生根前期培养基为: 1/2MS+0.1%AC，培养3 周，然后继代到1/2MS培养基上，培养3 周。生根培养基为: MS+1.0 mg·L^-1IBA+0.5 mg·L^-1NAA。

根据油松组织培养过程中不定芽出现的形态划分为丛芽状不定芽和芽苗状不定芽。丛芽状不定芽为组织培养中或在增殖过程中出现的丛芽块，具有一定的苗高和芽块直径; 芽苗状不定芽为组织培养中或在增殖过程中出现的独立苗芽，具有一定的苗高。对这2种不同苗态的油松不定芽进行生根诱导，每处理12 个，重复3 次，生根培养前和生根培养后统计不同苗态不定芽的生根数，计算生根率。

4)培养时间、培养规格和丛芽生物量对生根的影响选取直径在0.1~0.2 cm、苗高在0.2~0.9 cm范围内的油松不定芽，培养在增殖壮苗培养基上，每组芽块10 个，重复3 次，培养时间分别为2，4，6，8 周，然后进行生根前期的培养，最后转接到生根培养基上培养4 周，分别统计丛芽直径、苗高，并计算生根率。

选取直径在0.3~1.2 cm范围内的油松丛芽块，以组间差0.3 cm将其分为4 个直径组，分别为1.2，0.9，0.6，0.3 cm。将其培养在壮苗培养基上，培养时间分别为2，4，6，8 周，将各个直径组中所得直径在0.8~1.0 cm、苗高在3.0~5.1 cm范围内的相应芽块进行生根前培养，然后转接到生根培养基上，每组10 个处理，重复3 次，4 周后分别统计丛芽块的苗高、直径，计算生根率。

选取直径在0.3~1.2 cm的油松丛芽块，以组间差0.3 cm将其分为4 个直径组，分别为1.2，0.9，0.6，0.3 cm。将其培养在壮苗培养基上，增殖培养时间为4周，将各个直径组中所得相应芽块进行生根前培养，然后转接到生根培养基上，每组10 个处理，重复3 次，然后，进行生根处理4周，统计丛芽块的苗高、直径、生物量(鲜质量)，计算生根率。

培养基均附加30 g·kg^-1蔗糖、5.5 g·kg^-1琼脂，pH5.6~5.8。植物激素在灭菌前加入培养基中，采用121 ℃高温灭菌30 min。培养温度为(25±2)℃，每日充分光照14 h，光照强度为2 000~3 000 lx。

数据统计使用DPS数据统计软件。

将油松成熟胚(图 1-1)接种在1/2 MS改良培养基上，1 周后胚开始膨大、变绿(图 1-2)，1 个月后诱导出不定芽(图 1-3)。为了便于统计和说明，根据不定芽生长状况，将油松不定芽分为3个级别。Ⅰ级: 不定芽生长旺盛，叶色鲜绿，针叶粗壮(图 1-4); Ⅱ级: 不定芽生长较旺盛，绝大多数针叶鲜绿(图 1-5); Ⅲ级: 生长差，针叶枯褐(图 1-6)。不同处理的油松不定芽生长状况统计见表 1。

表 1 不同切分的油松不定芽生长状况^① Tab.1 Growth of adventitious bud after different dividing treatments

表 1 不同切分的油松不定芽生长状况① Tab.1 Growth of adventitious bud after different dividing treatments 油松不定芽生长等级Growth grade of adventitious bud (%) 2分处理Dividing into2 pieces 3分处理Dividing into3 pieces 4分处理Dividing into4 pieces 5分处理Dividing into5 pieces ①表中不同字母表示多重比较的t检验在P ≤0.05水平上差异显著。下同。Values followed by different letters are significantly different at P≤0.05 according to Tukey test. The same bellow. Ⅰ级率First-rate 90a 73.3a 43.3b 23.3b Ⅱ级率Second-rate 10b 23.3a 30a 33.3a Ⅲ级率Third-rate 0c 3.4c 26.7b 43.3a

图 1 油松离体胚不定芽诱导及生根 Fig. 1 Adventitious bud and root induction in Pinus tabulaeformis zygotic embryos 标尺Bar:1 cm. 1.成熟胚; 2.成熟胚在改良1/2 MS培养基上培养1 周; 3.不定芽; 4.生长最好的Ⅰ级不定芽; 5.生长较好的Ⅱ级不定芽; 6.生长较差的Ⅲ级不定芽; 7,8.丛芽状不定芽; 9.芽苗状不定芽; 10.不定芽的不定根(短箭头)。 1. Mature embryo; 2. Mature embryo was cultured on modified 1/2 MS medium a week; 3. Inducted adventitious buds; 4. The first-rate adventitious buds grow best; 5. The second-rate adventitious buds grow better; 6. The third-rate adventitious buds grow worse; 7, 8. Adventitious bud cluster; 9. Adventitious buds; 10. Adventitious buds’ adventitious root (short arrows) .

油松丛芽分2块处理的Ⅰ级率最高，达90%，无Ⅲ级苗; 分5块处理的Ⅰ级率在各处理中最低，为23.3%，而Ⅲ级率在各处理中最高，为43.3%。各切块处理间差异极显著。

在分块的4种处理方法中，分2 块和分3 块2种处理中Ⅰ级率、Ⅲ级率差异均不显著，但与其他2种处理方法相比，差异显著。分2块处理和分3 块处理为最优的处理方法，分2 块处理所得的不定芽块长势较好，而分3 块处理的不定芽增殖率较大，因此，分3 块处理为最佳，更具实际应用意义。

对油松丛芽状不定芽(图 1-4)和芽苗状不定芽(图 1-5)进行根诱导，不同苗态不定芽的生根率分别为91.7%和38.9%(表 2)。丛芽状不定芽的生根率高于芽苗状不定芽 ，并且，在相同的培养条件下，丛芽状不定芽多生长旺盛，叶色鲜绿，针叶粗壮，增殖能力强(图 1-7)，而芽苗状不定芽在培养过程中针叶容易褐化和枯死(图 1-9)。

表 2 不同苗态不定芽的生根诱导情况 Tab.2 Rooting of adventitious bud in different growth type

表 2 不同苗态不定芽的生根诱导情况 Tab.2 Rooting of adventitious bud in different growth type 不同苗态的不定芽Type of adventitious bud 培养数Number of cultured adventitious buds 生根数Number of rooted adventitious buds 生根率Rooting rate (%) 丛芽状Adventitious bud cluster 36 33 91.7 芽苗状Adventitious buds 36 14 38.9

1)增殖壮苗时间对生根的影响      根据生根壮苗的处理时间和处理结果对应的丛芽块直径情况，以组间差0.35进行分组，各组丛芽块直径主要分布范围为: 0.30~0.65 cm，0.65~1.00 cm，1.00~1.35 cm，1.35~1.70 cm，并将各组芽块对应的主要苗高分布范围划分为: 0.9~3.5 cm，3.5~6.1 cm，6.1~8.7 cm，8.7~11.9 cm。各组芽块经不同时间培养后的芽块直径、芽高、生根情况统计如表 3。

不同处理间生根率差异显著。不定芽生根率随着不定芽块培养时间的增加，呈现先增大后减小的趋势，增殖壮苗培养4周的不定芽丛芽块生根率最高(73.3%)，其不定芽丛块直径主要分布范围为0.65~1.00 cm，不定芽高的主要分布范围为3.5~6.1 cm(表 3)。培养6 周时，不定芽的生根率为36.7%，培养8 周时，不定芽的生根率为26.7%。由表 3可知，不定芽丛芽块的直径和苗高均随着培养时间的增加而增大。

表 3 培养时间对油松不定芽生根的影响 Tab.3 Effect of culture period on rooting of P. tabulaeformis adventitious buds

表 3 培养时间对油松不定芽生根的影响 Tab.3 Effect of culture period on rooting of P. tabulaeformis adventitious buds 培养时间Culture period /week 生根丛芽块直径Diameter of rooted adventitious bud cluster /cm 生根丛芽高Length of rooted adventitious bud cluster /cm 培养数Number of cultured adventitious bud cluster 生根数Number of rooted adventitious bud cluster 平均生根率Aver. rooting rate(%) 2 0.30~0.65 0.9~3.5 30 8 26.7b 4 0.65~1.00 3.5~6.1 30 22 73.3a 6 1.00~1.35 6.1~8.7 30 11 36.7b 8 1.35~1.70 8.7~11.9 30 11 26.7b

2)不定芽丛芽块大小和培养时间对不定芽生根的影响      大小不同的丛芽块，经不同时间的增殖壮苗培养，得到大小基本相同(平均直径0.8~1.0 cm，鲜质量0.9~1.25 g)的丛芽块，诱导生根情况统计如表 4。

表 4 不定芽丛芽块大小和培养时间对油松不定芽生根的影响 Tab.4 Effect of adventitious bud cluster size and culture period on rooting of P. tabulaeformis adventitious buds

表 4 不定芽丛芽块大小和培养时间对油松不定芽生根的影响 Tab.4 Effect of adventitious bud cluster size and culture period on rooting of P. tabulaeformis adventitious buds 培养时间 Culture period/week 初始培养不定芽丛直径Initial diameter of adventitious bud cluster /cm 培养数Number of cultured adventitious bud cluster 生根数Number of rootedadventitious bud cluster 平均生根率Aver. rooting rate(%) 2 1.2 30 26 86.7a 4 0.9 30 20 66.7b 6 0.6 30 14 46.7c 8 0.3 30 9 30.0d

由表 4可知，不同处理间不定芽丛芽块生根差异显著。初始培养芽块比较大，达到目的芽块规格的培养时间短，生根效果好。而初始培养较小的芽块，延长培养时间同样可以达到目的芽块规格，但是，不定芽丛芽块的生根能力有随着培养时间的增加而逐渐降低的趋势。

3)丛芽块生物量对不定芽生根的影响     大小不同的油松不定芽块经增殖壮苗培养4 周，统计各组芽块的直径、平均芽高、生根的不定芽块个数及生根率(表 5)。由表 5可知，在增殖壮苗培养时间相同的情况下，油松不定芽块的生根率与芽块直径增量、芽长、不定芽鲜质量有一定的关系，随着这3项指标的增加而增大。不定芽丛芽块直径增量最大为0.36 g、平均芽长最大为6.5 cm时，对应的鲜质量最大为0.91 g，油松不定芽丛芽块生根率为86.7%; 不定芽丛芽块直径增量为0.15 g、平均芽长为5.6 cm时，对应的芽块鲜质量为0.8 g，不定芽生根率为70.0%; 不定芽丛芽块直径增量最小为0.12 g、平均芽长最小为5.4 cm时，对应的培养物鲜质量最小为0.65 g，其丛芽块生根率为46.7%。油松丛芽块整体大小影响不定芽的生根，在不定芽芽块状态相同的情况下，以不定芽丛芽块直径和芽长对应丛芽块的鲜质量，即在一定时间内，芽块增加的鲜质量越大，丛芽块生根率也比较大。

表 5 油松不定芽丛芽块生物量对不定芽生根的影响 Tab.5 Effect of adventitious bud cluster biomass on rooting of P. tabulaeformis adventitious buds

表 5 油松不定芽丛芽块生物量对不定芽生根的影响 Tab.5 Effect of adventitious bud cluster biomass on rooting of P. tabulaeformis adventitious buds 初始培养不定芽块直径Initial diameter of adventitious bud cluster /cm 生根不定芽丛块直径Diameter of rooted adventitious bud cluster /cm 生根不定芽丛平均芽长Average length ofrooted adventitious bud cluster /cm 生根不定芽丛块鲜质量Fresh weight of rooted adventitious bud cluster /g 培养数Number of cultured dventitious bud cluster 生根数Number of rooted adventitious bud cluster 生根率Rooting rate (%) 1.2 1.35 5.6 0.80 30 21 70.0b 0.9 1.26 6.5 0.91 30 26 86.7a 0.6 0.78 5.5 0.78 30 18 60.0c 0.3 0.42 5.4 0.65 30 14 46.7b

在油松不定芽诱导过程中，生长旺盛、叶色鲜绿、针叶粗壮的Ⅰ级油松不定芽具有不断增殖和生根的能力，Ⅲ级不定芽生长差、针叶枯褐，增殖和生根能力差，因此，在诱导不定芽并进行生根时，不定芽块Ⅰ级率越大越有效，Ⅲ级率越小越有效; 在比较不定芽的不同切分处理中，既要求保持所得不定芽块Ⅰ级率最大，又要求有较大的增殖率。本试验中，对不定芽丛芽块进行切分2 块与切分3 块的2种处理所得I 级率相同的情况下，选择3 块切分处理方法更具生产意义。

通常，添加了细胞分裂素和生长素的培养基上容易诱导出植物丛生芽。本试验中，培养基中添加了KT和NAA，这与李科友等(2008)诱导西黄松(Pinus ponderosa)时添加较高浓度的细胞分裂素/生长素组合(BA和NAA)诱导丛生芽效果较好的结论相同。在本试验中，观察到不定芽丛芽块的增殖能力及生长状况均比芽苗状不定芽好，因此，在油松不定芽增殖壮苗培养中，在切分一定规格的不定芽丛芽时，应尽量避免出现芽苗状不定芽，可以将培养物着重培养为一定规格的目的丛芽块，以提高油松不定芽的生根率。在植物组培快速繁殖中，将不定芽丛芽块切分增殖，继续培养为可切分的丛芽块，理论上，这样可以无限增殖下去，但是，培养不定芽丛芽块的时间长短又会影响不定芽的生根。

在不定芽根诱导前期的增殖壮苗阶段，过长时间的培养会增加愈伤组织，并且，会使不定芽超度含水(Saborio et al.，1997; Álvarez et al.，2009)，从而不利于不定芽的培养和生根。Alonso等(2006)在对意大利松(Pinus pinea)组织培养中发现: 短时间的不定芽诱导会增加不定芽根的诱导率。在对针叶树种不定芽进行根诱导前期培养的研究中，Capuana等(1995)、Moncaleán等(2005)分别得出意大利松在培养3 周和5 周时诱导不定根效果最好的结论。StojičićD等(1999)在对波士尼亚松(Pinus heldreichii)不定芽的根诱导中得出结论: 利用培养2~4 周的不定芽进行根诱导时，生根率最高，但是，生根率随着培养时间的增加而降低。Montalbán等(2011)得出结论: 在添加5 μmol·L^-1 BA培养基中培养3周的辐射松(Pinus radiata)不定芽的根诱导率最高。本试验中，规格相同的不定芽在增殖壮苗培养基上培养4 周，生根率可高达73.3%，但随着培养时间的增加不定芽生根率逐渐降低，该结论与针叶树种组织培养的相关研究结论(Saborio et al.，1997; Alonso et al.，2006; Álvarez et al.，2009)一致。而在培养一定规格的目的芽块时，初始培养直径最大为0.9 cm的芽丛块，培养2 周后即可达到目的芽块的规格，丛芽生根率高达86.7%。因此，选择合适的培养时间对提高油松不定芽生根率至关重要，培养时间过短或过长均会增加油松不定芽生根的难度，选择适合的培养时间，可以提高生根材料的利用率，降低生产成本。

不定芽的芽长对生根有一定的影响，Montalbán等(2011)在对辐射松的不定芽诱导中发现芽长大于15 mm的不定芽更适于生根。本试验中，生根的油松不定芽丛具有一定的芽块直径和一定的不定芽长度，试验中，生根率最高的油松不定芽芽长大于6.0 cm，但最重要的是丛芽块必须有一定的生物量，在试验中发现，生根的不定芽块苗长并非很长，但有一定数量的不定芽(图 1-7)，或者不定芽并不多但有一定的芽长度(图 1-8)，表明不定芽生根与生根培养时芽块的大小即生物量有一定的关系; 经过一定时间的增殖壮苗培养，积累生物量大的芽块经生根培养后，生根率较高(本试验中，芽丛块鲜质量为0.91 g时，生根率为86.7%)(图 1-10)，而丛芽块鲜质量比较小时，生根率相对较低。在油松组培苗的增殖壮苗阶段，应注意切分不定芽块到适当大小，切块太小，培养到目的规格芽块的时间长且生根率低。本试验中，油松不定芽块在一定培养时间内生根率较高的切块大小为: 平均芽块直径为0.9 cm。

本文试验中，油松不定芽是根据试验设计经过人为筛选的，对油松不定芽的培养规格具有一定的参考意义，今后还应该探索不同生长苗态和不同规格不定芽各自的适合生根的培养时间和生物量大小。