花斑(Spalting)是指由真菌引起木材着色形成的花斑纹(Robinson et al.，2009)，人们可利用真菌着色使木材具有独特的装饰效果(Robinson et al.，2011a)。在北美洲，花斑木从15世纪开始已成为一种流行的工艺材料(Blanchette et al.，1992)，目前具有形成大规模市场的潜力(Robinson et al.，2010a)。利用真菌形成的具有美丽花斑纹的木材作为装饰材料可制成高价装饰品，如花瓶和贴面单板(郭梦麟等，2010)。目前国内刚刚开始对花斑木开展相关研究和利用。

20世纪80年代，美国杨百翰大学设立了最早的花斑木研究室，并于1987年分离确定了几种能形成带线花纹的白腐菌(Wikipedia，2012)。后续的研究发现，形成带线花纹的主要是担子菌和子囊菌(Robinson et al.，2010b)。目前常见的有7种真菌能形成可靠的基本固定不变的花斑: Xylaria polymorpha、Trametes versicolor、Bjerk and era adusta、Polyporus brumalis、Arthrographis cuboidea、Chlorociboria aeruginascens、Ceratocystis virescens(Robinson et al.，2010a)。X.polymorpha是花斑木试验研究中常用的形成带线花纹的真菌。T.versicolor 是常见的可快速造成白腐的真菌(戴玉成，2010)，与其他菌种组合接种于木材上可形成腐朽较轻的花斑(Robinson et al.，2007)。A.cuboidea在木材表面及内部形成红色，其中不同株的染色能力不同(Robinson et al.，2011b)。Ch. sp.形成可深入木材的绿色(Blanchette et al.，1992)，Ce. virescens形成可深入木材的蓝色(Wikipedia，2012)。

花斑木的形成是真菌作用于活立木或木材的结果，一定菌种在一定树种上形成的花斑基本固定不变，因此筛选出可形成花斑的菌种对花斑木菌种资源收集利用及花斑木形成机制研究有重要意义。

2011年4月9日及29日分别于云南省昆明市金殿公园及其附近林地采集花斑木标本，树种包括尼泊尔桤木(Alnus nepalensis)、梨(Pyrus sp.)、高盆樱桃(Cerasus serasoides)等。

试验方法参考方中达(1998)、伍建榕等(2007)分离纯化真菌的方法，Robinson等(2010b)及Liers等(2005)培养及接种真菌的方法。

分离纯化:取具花斑的部分切成小块，75%酒精浸泡10~20 s，0.1%氯化汞中浸泡3~6 min，无菌水洗涤后接于PDA培养基上，于(26±2)℃恒温箱中培养，纯化并保存。

培养及接种真菌:以2种方法扩繁，一是在PDA培养基上扩繁至菌丝几乎布满平板，为固态菌种; 二是在PDA培养基(无琼脂)中旋转震荡培养至形成明显成团的菌丝体，为液态菌种。木材锯成2×2×3(cm)小块，每瓶1~3块置于4×4×12(cm)培养瓶中并加约17 mL水，蛭石装入三角瓶并加水至湿润，用高压蒸汽灭菌器以121 ℃0.1 MPa灭菌60 min。接种前将培养瓶中剩余水分倒出。固态菌种接种是用解剖刀把菌落切成约2 cm²小块贴在木块上，液态菌种接种是用镊子夹菌丝体到木块上。接种后以蛭石覆盖，于(26±2)℃培养箱中黑暗培养。每株菌株重复12瓶，隔2个星期每株取3瓶观察。

通过观察、扫描或拍照记录花斑形成的颜色、深度、腐朽情况，将腐朽轻、染色多、带线多的菌株作为有效菌株。

形态鉴定: 观察真菌的菌丝、产孢结构、孢子等形态特征，参照《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)、《半知菌属图解》(巴尼特等，1972)鉴定。分子鉴定: 以试剂盒法提取菌株总DNA，以菌株DNA为模板，以引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，PCR反应体系为: 2 μLDNA模版、1.5 μL引物ITS1、1.5 μL引物ITS4、Taqmix25μL、去离子水20 μL，总体系50 μL。PCR反应程序为: 94 ℃4 min; 94 ℃1 min，50 ℃45 s，72 ℃1 min，35个循环; 72 ℃10 min。将PCR反应产物送到生物科技公司测序得ITS序列，经校对，利用NCBI Blast工具进行最大相似度比对。

共筛选出有效菌株14株。菌株J1-2及QM-4在7天后即可形成表面不均匀红色，4周后染色面积更大，色彩更红(图 1a); 其余12株形成相似而略有差别的带线花纹，带线随培育时间延长而深入木块(图 1b-e)。所选有效菌株在西南桤木、西南桦、轻木、毛白杨、思茅松上均可形成相似花斑。一些菌株(J2-2，HD-4，J9-1)造成的腐朽较轻，带线较丰富; 各菌株在毛白杨上形成的带线花纹较其他材种更丰富。液态菌种接种形成的带线花纹倾向于无规则的错综复杂的图案，深色染色较多(图 1b); 固态菌种接种形成的带线花纹倾向于小圈闭合状图案，深色染色较少(图 1c)。而L-2两种接种方式形成的圈为粗线的大圈，与J2-2等株由表及里形成的细线不同，粗线的大圈贯穿于木块中部(图 1d-e)。

	图 1 不同真菌形成的花斑特征 Fig. 1 Characteristics of spalting inoculated with different fungi a. Nectria rigidiuscula; b.Xylaria venosula; c. 拟茎点霉Phomopsis sp.; d-e.蔡氏轮层炭角菌Daldinia childiae.

鉴定为9种，并通过分子鉴定验证，如表 1所示。

表 1 菌株鉴定结果 Tab.1 Strains identification results

表 1 菌株鉴定结果 Tab.1 Strains identification results 序号No. 菌株Strains 拉丁名Latin names 中文名Chinese names 1 J1-2,QM-4 Nectria rigidiuscula — 2 J2-2,J12 Xylaria venosula — 3 C-1 Xylaria sp. 炭角菌 4 L-1 Xylaria sp. 炭角菌 5 YT-1 Xylaria sp. 炭角菌 6 J6-1 Nemania diffusa 扩散炭层菌 7 L-2,YT-2,J13-2,SQ Daldinia childiae 蔡氏轮层炭角菌 8 J9-1,J13-3 Phomopsis sp. 拟茎点霉 9 HD-4 Graphium sp. 粘束孢霉

菌种形态特征描述如下，沿用表 1序号。

1. Nectria rigidiuscula。7天，菌落直径49 mm，厚约4 mm，圆形，具轮纹，疏松绒状; 菌丝末端白色，中间红色，培养基红色，中央产黄色粘液状分生孢子团; 镰刀形孢子产自瓶型分生孢子梗，6~9分隔，两端细胞透明，渐弯曲细削，(60~80)μm×(7~12)μm; 卵圆形分生孢子(5~7)μm×(3~4)μm(图 2a，b)。

	图 2 形态特征鉴定 Fig. 2 Morphological identification a-b.镰刀菌分生孢子Conidia of Fusarium sp.;c-e. Xylaria venosula子实体,c为野外生长形成,d-e为培养形成Sporocarp of Xylaria venosula(Nature growth in Fig.c,cultivation in Fig.d-e);f.蔡氏轮层炭角菌子实体Sporocarp of Daldinia childiae;g-h.拟茎点霉子座及孢子Stroma and conidia of Phomopsis sp.;i.粘束孢霉胞梗束Conidiophores of Graphium sp.

2. Xylaria venosula。9天，菌落直径65 mm，平展，圆形，具轮纹; 菌丝密实，短绒状，白色，背面有一圈黑色轮纹，边缘平整; 15天形成0~1 cm黑色短棒状子实体。直立黑色棍棒状子实体(图 2c)，高1~2.5 cm，直径0.1~0.4 cm，内部白色，子囊壳球形，子囊圆筒形，深色子囊孢子8个，有侧丝。在木块上培育8周形成1~4.5 cm黑色棍棒状不育子实体(图 2d，e)。

3. 炭角菌。7天，菌落直径33 mm，平展，正面白色，背面浅黄色，圆形; 菌丝密实，短绒状，边缘平整; 15天形成0~0.3 cm直立黑色分枝棒状子实体，末端白色，未产生孢子; 木块培育无子实体产生。

4. 炭角菌。7天，菌落直径45 mm，平展，白色，圆形; 菌丝密，绒状，边缘平整，扇形突出，具轮纹; 15天形成0~0.5 cm直立黑色分枝棒状子实体，末端白色，未产生孢子; 木块培育无子实体产生。

5. 炭角菌。7天，菌落直径43 mm，平展，白色，边缘微隆起，圆形; 菌丝密，绒状，边缘平整，扇形突出。直立棍棒状子实体，子囊壳埋于子座内，深色子囊孢子8个，有侧丝。木块培育无子实体产生。

6. 扩散炭层菌。7天，菌落直径41 mm，平展，中央微隆起，圆形，正面白色，背面浅黄色; 菌丝密，绒状，边缘平整。黑色垫状炭质子座常连成一片，球形子囊壳埋生于炭质组织间，8个子囊孢子单胞暗色。

7. 蔡氏轮层炭角菌。7天，菌落布满平板，圆形，扁平; 菌丝疏松棉絮状，由白色变为浅褐色，边缘平整; 15天后菌落为黑色，色素渗入培养基; 散发清甜香味。半球形漆黑色子座(图 2f)，无柄，聚生或单生，直径1~2.5 cm，高1.3~1.6 cm，黑色木质轮层，子囊壳管状，子囊孢子深色，椭圆形。

8. 拟茎点霉。7天，菌落直径83 mm，正面白色，背面浅黄褐色，形状不规则; 菌丝密集，毛毡状，边缘不平整; 15天后菌落为粉色，散生直径1~4 mm黑色块状子座，分生孢子器埋生，分生孢子一种卵圆形至纺锤形，一种线型(图 2g)，另有一种厚壁孢子形成于子座外的菌丝上(图 2h)。

9. 粘束孢霉。7天，菌落布满平板，圆形，具轮纹，正面奶白色，中央部位少许菌丝呈黄色束状，背面黄褐色且轮纹色较深; 菌丝疏松，绒毛状，边缘平整。在木块上培育 8周产胞梗束，中、下部黑褐色，上部浅褐色，散开的顶部产无色单胞椭圆形分生孢子(图 2i)。

将所得序列在NCBI中比对后，选择相似度最大的1~2株GenBank序列，选择Neurospora crassa 与Morchella conica作为外类群，使用Mega 4.0软件以 NJ法构建系统发育树。所得发育树包括2个大类群，其中小的分支为Neurospora crassa与Phomopsis sp.构成，大的分支为炭角菌科真菌所构成，包括Xylaria、Daldinia、Nemania(图 3)。

	图 3 基于ITS序列和NJ分析方法构建的系统发育树 Fig. 3 The phylogenetic tree based on ITS sequences with NJ

筛选所得菌株均属于子囊菌及半知菌，有性态均为子囊菌，其中以炭角菌科炭角菌属真菌居多。所得炭角菌属真菌均造成木材白腐，其中X.venosula腐朽速度最慢，带线较丰富，是银杏(Ginkgo biloba)及药用石斛(Dendrobium nobile)的内生真菌(张禧庆等，2008;刘小莉等，2009);拟茎点霉属(Phomopsis sp.)及粘束孢属(Graphium sp.)的内真菌多为植物病原真菌，且一株拟茎点霉被报道为印楝(Azadirachta indica)内生真菌(吴少华等，2008)，这2株菌腐朽慢，带线丰富。X.venosula、拟茎点霉及粘束孢霉是花斑木培育的优选菌种，三者为植物内生真菌或病原真菌，腐朽木材的速度比一般白腐菌慢。

N. rigidiuscula无性态为镰刀菌，菌丝体红色，色素渗入PDA培养基，7天可将木材表面染红色，随时间延长不深入木块内部，不造成木材腐朽，为菌丝分泌色素到菌丝体外使木材细胞染色。诸多镰刀菌属真菌及其他真菌可在基物上产生红、黄、绿等色素，可利用真菌染色使木材甚至织物等其他材料染色，产生更多形式与色彩。

一些担子菌例如刺槐多年卧孔菌(Perenniporia robiniophila)(戴玉成等，2005)、淡黄木层孔菌(Phellinus gilvus)(戴玉成等，2004)及能使寄主染红色的硬锈红菌(Erythromyces crocicreas)(Qin et al.，2009)、红木色孔菌(Tinctoporellus epimiltinus)(Dai，2012)或可形成花斑。从系统发育树可知2大分支亲缘关系较远，说明可形成带线花纹的真菌类群较广泛。

所得菌株在试验树种上均形成花斑，在毛白杨形成的带线及染色数量最多，其次为西南桦、尼泊尔桤木和轻木。而Robinson等(2010b)比较糖槭(Acer saccharum)、美洲山杨(Populus tremuloides)、黄桦(Betula alleghaniensis)，美洲椴(Tilia americana)后发现美洲山杨是形成带线最丰富的树种。

液态菌种接种时，菌丝体携带培养液，因此菌株培育时生长快，菌落茂盛，菌丝体覆盖木块，最终形成错综复杂的带线花纹; 固态菌种接种生长慢，在约5周后因易于吸收利用的营养消耗或干燥生长势走向衰退，随后在衰退时菌丝集结处留下深入木块的闭合的圈状的带线花纹。

花斑木在实验室的培育是成功的，但大规模花斑木生产还需考虑过程易污染、菌种保藏及可能的菌株活力退化等问题。

国外多数研究认为带线的形成是由于菌种间的对抗或单株真菌菌丝体细胞不亲和性(Robinson et al.，2010c)，但未能证明，解释诸多菌种以单一菌株形成错综复杂的带线花纹也较牵强。试验中，带线时常形成于在蛭石与木块及木块与培养瓶接触面的边缘，说明菌株在遇到阻碍时易形成带线。在病理学方面，Henson等(1999)认为植物病原真菌(禾顶囊壳菌Gaeumannomyces graminis，无性态为瓶霉属Phialophora)形成黑色素是为了保护组织对抗不良环境压力，甚至不直接与致病性相关。