北美云杉(Picea pungens)为松科(Pinaceae)云杉属(Picea)常绿乔木，株高可达30 m左右，树冠呈圆锥形，叶色呈淡湖蓝色，针叶长约2~3 cm; 雌雄同株，球果长卵形，成熟时黄褐色至褐色。原产北美落基山中部的犹他州和科罗拉多州，在亚利桑那州和新墨西哥州也有分布，纬度跨越34°—45°N(李爱平等，2006)。因其淡湖蓝色的叶片极具观赏价值，国内作为彩叶树种进行了引种，目前国内仅对北美云杉的种子处理、补光处理和一些外生菌根的筛选进行了研究(李爱平等，2006; 郑红娟等，2008)。引种过程中发现，不同种源的生长状况存在一定的差异(李爱平等，2008); 栽培技术不同，同一种源的植株针叶叶色也存在差异(杜蕊等，2012)。目前，对于植物叶片呈色的研究主要集中在彩叶植物叶片的色素组成和含量方面(李保印等，2004;张平，2008; 朱书香等，2009); 而对于针叶树，许多种或品种针叶呈现蓝色，造成这种蓝色的原因至今没有系统的报道。因此，为分析北美云杉针叶呈现蓝色的原因，利用英国皇家园艺协会比色卡，测定北美云杉不同株龄实生苗以及北美云杉品种'Glauca Globosa’(P. pungens'Glauca Globosa’)的针叶颜色，并通过光学解剖镜对蓝色针叶和绿色针叶的形态进行了观测和比较。结果显示，针叶表面的覆盖物直接造成叶片呈现蓝色。因此，进一步通过扫描电镜观测了叶片结构和表面覆盖物的形态和排列方式，同时采用质谱-气相色谱技术(GC-MS)分析其表面覆盖物的成分。该研究对探究北美云杉及其他针叶树针叶呈现蓝色的原因提供了一定的理论支持。

试验材料包括1年生、4年生、35年生的北美云杉植株(每一龄植株不少于10株)和北美云杉品种'Glauca Globosa’12年生植株。其中北美云杉1年生播种苗，苗高3~10 cm，针叶蓝色性状表现不明显; 4年生播种苗，苗高26~56 cm，部分种苗表现蓝色性状，即在新生枝条上的针叶呈现蓝色;35年生植株种植于北京植物园，株高9~15 m，冠幅3~6 m，树形为柱状至金字塔状，结构紧凑，表现蓝色性状的35年生北美云杉，针叶呈现均匀的淡湖蓝色; 'Glauca Globosa’12年生植株，株高30~50 cm，整株为圆球型，叶片呈现均匀的淡湖蓝色，观赏性强。选取生长健壮的植株的针叶作为试验材料。

1)不同年龄北美云杉和品种'Glauca Globosa’的针叶颜色比较    分别在1年生、4年生和35年生北美云杉不同植株上随机取1年生枝条上的针叶，每龄不少于100个; 其中35年生北美云杉的针叶取自高度在2 m以下的枝条。在由北面射入的日光散射光源下，将针叶中间部分的颜色与英国皇家园艺学会色谱标准(RHSCC)进行对比，观察记录比色结果; 并以12年生'Glauca Globosa’的蓝色针叶作为对照。

2)针叶在解剖镜下的观测和比较    分别在长势健壮的1年生、4年生和35年生北美云杉植株上取蓝色和绿色针叶，并以品种'Glauca Globosa’的蓝色针叶为对照，在LEICA DM LS2解剖镜下观察。再分别用水、氯仿浸泡蓝色针叶，振荡后浸泡2 min取出，晾干后放到解剖镜下观测，在100倍下用计算机获取图像，重复3次。

3)针叶覆盖物的扫描电镜观察    分别在长势健壮的1年生、4年生和35年生北美云杉植株上取蓝色和绿色叶片，并以品种'Glauca Globosa’的蓝色针叶为对照，用扫描电子显微镜(日立5-3400N)观察、拍照。

由于材料自然干燥会皱缩，但固定等处理又会破坏其表皮覆盖物的结构，因此依据不同目的，采取了2种处理方法: 一是以观察针叶表面覆盖物为目的，将样品置于室温下干燥器中干燥;二是以观察针叶横截面和气孔结构为目的，用FAA固定针叶，系列酒精脱水，之后进行临界点冷冻干燥。2种处理后的针叶都选取中间部分长5~6 mm的小段，用双面胶带纸粘于样品台上，分别使叶片表面、横截面朝上。置E-1010离子溅射仪中进行真空喷镀，再于扫描电镜下观察(贾敬莺等，1996; 邵邻相等，2005)。

4)质谱-气相色谱技术(GC-MS)测定叶片表面分泌物的成分    (1)样品处理    从蓝色性状表现良好的35年生北美云杉上随机取蓝色针叶，放入氯仿中常温浸泡10 s，震荡后，取出针叶，充分溶解后，过滤，得到2 mL滤液。重复3次，得到3个样品，并用2 mL氯仿作为对照。(2)色谱条件(杨爱梅等，2011)HP5MS色谱柱: 石英毛细管柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25μm); 进样口温度: 280 ℃; 进样量: 1 μL;进样方式: 分流; 分流比: 0; 程序升温: 初始温度50 ℃(5 min)→280 ℃(8 ℃·min^-1); 载气: He;载气流量: 1 mL·min^-1。(3)质谱条件接口温度: 250 ℃; 离子源温度: 220 ℃; 离子源电离能: 70 eV。(4)成分分析方法用质谱数据库检索各色谱峰的质谱裂片图，查阅相关资料给组分定性，鉴定出主要的组分，并按面积归一化法确定各组分相对质量百分含量。

比色结果显示，北美云杉1年生幼苗针叶颜色主要分布在134-A和134-B，呈绿色。在4年生种苗中，有8.47%的植株有较为明显的蓝色针叶; 其蓝色叶的叶色为133-A和133-B，其中67%为133-A，33%为133-B，呈蓝绿色;绿色针叶的叶色主要为134-A和134-B，其中73%为134-A，37%为134-B。表现蓝色性状的35年生北美云杉植株的外层针叶颜色较为均匀，为133-C，呈灰蓝色。品种'Glauca Globosa’叶色灰蓝而且均匀，叶色均为133-C(比色卡中134呈现绿色，133呈现蓝绿色，并且每一数据颜色从A到C逐渐变浅，绿色表现变弱，蓝色表现增强)。

在光学解剖镜下观察发现，在针叶表皮上，气孔在每个面上呈直线排列，每个面有2~6条气孔线，气孔呈白色。

对相同株龄北美云杉的蓝色针叶和绿色针叶的观察发现: 蓝色针叶表皮有一层物质，绿色针叶不明显，只在气孔处有分布; 这层物质可以通过摩擦方式去掉，不能溶于水，但可以溶于氯仿等有机溶剂。经摩擦或溶于氯仿后，用比色卡比较叶色，主要为134-A和134-B。说明去掉这层物质后的蓝色针叶失去了蓝色的性状，呈现绿色。因此，初步推断，颜色差异主要是表皮覆盖物造成的。对覆盖物进行进一步观察和分析。

在扫描电镜下观察结果显示，不同年龄、不同颜色针叶的表面覆盖物明显不同。从整体上看，蓝色针叶表皮上有明显覆盖物(图 1-1)，绿色针叶没有(图 1-2)。进一步放大发现，品种 'Glauca Globosa’(图 1-3)和35年生北美云杉蓝色针叶(图 1-4)的整个表皮上覆盖了较密的"白霜"状物质，只能看到气孔器轮廓，看不到表皮;4年生北美云杉蓝色针叶表皮"白霜"层较为稀疏(图 1-5)，而绿色针叶没有"白霜"层(图 1-6); 1年生针叶颜色变化虽不明显，但是有些针叶有非常稀疏的覆盖物，在表皮上呈团状分布，另外在气孔处分布较为密集(图 1-7)。放大1万倍发现，"白霜"状覆盖物是由大量棒条状物质密集而不规则地排列组成的晶体层(图 1-8，9)。

	图 1 北美云杉针叶的扫描电镜照片 Fig. 1 Photos of P. pungens' needles from scanning electron microscope

针叶的横切面呈四棱形(图 1-10)。气孔下陷，具孔下室，保卫细胞位于副卫细胞的下方。该结构与Sauter等(1986)对欧洲云杉(Picea abies)气孔观察到的结构相同。蓝色针叶的气孔开口处有大量覆盖物，有的形成一个明显的"盖"(图 1-11)。

通过观测针叶的横切面发现，不同材料的表面覆盖物厚度差异极显著(P<0.01)(表 1)，品种 'Glauca Globosa’针叶的覆盖物(图 1-12)厚度极显著大于35年生北美云杉(图 1-13)(P<0.01)，35年生北美云杉又极显著大于4年生北美云杉(图 1-14)(P<0.01)。绿色针叶表皮没有"白霜"层(图 1-15)。

表 1 蓝色针叶表皮覆盖物的厚度及多重比较^① Tab.1 Thickness of the cover on blue needles' epidermis and multiple comparisons

表 1 蓝色针叶表皮覆盖物的厚度及多重比较① Tab.1 Thickness of the cover on blue needles' epidermis and multiple comparisons 试验材料 Experimental material 覆盖物厚度 Thickness of the cover/μm ①多重比较采用最小显著差数法(LSD)，不同大写字母表示在0.01水平上差异极显著。Least significant difference test(LSD)is used in multiple comparison，and different capital letters indicate significant difference at 0.01 level. 4年生北美云杉 4-year-old P. pungens 1.706 7±0.399 05C 35年生北美云杉 35-year-old P. pungens 2.833 3±0.617 21B 12年生P. pungens 'Glauca Globosa’ 12-year-old P. pungens 'Glauca Globosa’ 4.380 0±0.634 94A

因此可以看出，北美云杉针叶表皮的覆盖物越多、分布越均匀、厚度越大，针叶呈现蓝色的程度也越明显。这种覆盖物是针叶呈现蓝色的一个重要原因。

通过扫描电镜观察到的覆盖物的晶体形态结构，与Jeyfree等(1971)、Sauter等(1986)、Jetter等(1994)观察到的云杉(Picea)针叶表面的蜡质晶体结构相同，由棒条状的物质密集而不规则地排列形成，因而推测这层覆盖物可能为一种蜡质。

采用GC-MS方法对北美云杉蓝色针叶表面覆盖物成分进行分析，经毛细管色谱分析分离出30余个峰(图 2);总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图，经计算机质谱数据库检索各色谱峰的质谱裂片图，共鉴定出19种主要成分，按面积归一化法确定各组分相对含量(表 2)。覆盖物的主要成分是2-甲氧基苯酚、二十一烷、十六烷、十五烷、二十八烷醇、十六烷酸等，这些组分主要为烷烃、环状化合物和脂肪族化合物。

	图 2 蓝色针叶表皮覆盖物成分的GC-MS图谱 Fig. 2 GC-MS spectrum of the constituents in epidermis coverage of the blue needles

表 2 北美云杉针叶表皮覆盖物成分GM-MS分析结果 Tab.2 The constituents analysis of the epidermis coverage from blue needles of P. pungens using GM-MS

表 2 北美云杉针叶表皮覆盖物成分GM-MS分析结果 Tab.2 The constituents analysis of the epidermis coverage from blue needles of P. pungens using GM-MS 序号 No. 保留时间 Retention time/min 化学名称 Chemical name 分子量 Molecular mass 相对含量 Relative content(%) 1 8.28 5-乙基-2甲基庚烷 Heptane，5-ethyl-2-methyl 142 1.61 2 8.92 5，7-二甲基十一烷 Undecane，5，7-dimethyl 184 6.14 3 9.03 4，7-二甲基十一烷 Undecane，4，7-dimethyl 184 3.75 4 9.57 2-甲氧基苯酚Phenol，2-methoxy 124 21.82 5 10.90 2-甲氧基-1-环己基-1-甲基硅烷Silane，2-methoxy-1-cyclohexyl-1-ethyl 188 6.75 6 11.70 十三烷Tridecane 184 1.48 7 11.92 6-甲基十二烷Dodecane，6-ethyl 184 1.59 8 12.08 2，4-二甲基苯甲醛Benzaldehyde，2，4-dimethyl 134 3.75 9 12.80 2，4-二甲基十二烷Dodecane，2，4-dimethyl 198 2.45 10 13.02 十五烷Pentadecane 212 7.43 11 15.32 2，6，10-三甲基十五烷Pentadecane，2，6，10-trimethyl 254 3.07 12 16.04 3，8-二甲基十一烷Undecane，3，8-dimethyl 184 1.38 13 16.11 2，3，7-三甲基十烷Decane，2，3，7-trimethyl 184 1.43 14 16.47 十八烷Octadecane 254 1.60 15 16.53 十六烷Cetane 226 8.47 16 16.84 2，4-二叔丁基苯酚Phenol，2，4-bis(1，1-dimethylethyl) 206 4.39 17 19.64 二十一烷Heneicosanoic 296 16.16 18 23.01 1-十六烷酸 1-Hexadecanoic acid 256 2.05 19 36.21 1-二十八烷醇 1-Octacosanol 410 4.69

通过光学解剖镜、扫描电镜观察和GC-MS分析，发现蓝色针叶表面上有一层"白霜"状覆盖物，其主要成分为烷烃、脂肪族化合物和环状化合物。其覆盖越厚，叶色呈现越明显的蓝色，观赏性越好。结合相关文献可知，植物表皮蜡质是覆盖在植物最外层的一类有机混合物总称，这类混合物不溶于水而溶于有机溶剂(氯仿等)(李魏强等，2006)。现已通过GC-MS技术测定多个植物物种的表皮蜡质成分，已鉴定出了100多种组分，这些组分主要是脂肪族化合物、环状化合物以及甾醇类化合物等，其中脂肪族化合物是最常见的组分，包括长链脂肪酸、醛、伯醇和仲醇(姚永花等，2011)。Barthlott等(1998)利用扫描电子显微镜观察了13 000多种植物表皮蜡质的形态结构并对其进行了系统分类和命名，将蜡质的微观形态结构分为柱状、棒条状、垂直片状、线状、烟囱状等26类，其中外蜡质层一般会形成自我组装的蜡质晶体，在特定的生长时期会形成肉眼可观察到的"白霜"状表型。因此，从形态特征和物质组分上分析，北美云杉蓝色针叶表面的覆盖物是一种蜡质晶体。

对比1年生、4年生种苗、35年生植株和品种 'Glauca Globosa’的针叶，发现: 1年生苗针叶变色不明显，针叶表皮有团状分布的蜡质分泌物; 部分4年生苗呈现蓝色，蓝色针叶分布在植株的新生枝条上，表皮有薄薄的均匀分布的蜡质分泌物; 表现蓝色性状的35年生植株几乎全株的针叶呈现均匀的湖蓝色，针叶表皮蜡质分泌物均匀分布，较厚; 品种'Glauca Globosa’整株的针叶呈现湖蓝色，针叶表皮蜡质层最厚。因此，植株蓝色的观赏性与表皮蜡质分泌物的量相关，分泌蜡质的针叶越多，蜡质层越厚，其蓝色的观赏性越好。

蓝色针叶的蜡质分泌物可以通过物理摩擦或是溶于有机溶剂而脱落，失去蜡质分泌物后针叶呈现绿色。因此，这种蜡质晶体是影响北美云杉针叶颜色的最直接、主要的因素。以往的报道显示，表面蜡质的覆盖程度对光的反射率有一定的影响(Reicosky et al.，1978)，从而可能影响了肉眼看到的叶片呈现的颜色。

针叶树中有部分种和品种具有蓝色的特性，这种特性使针叶树具有良好的观赏价值。表面蜡质是北美云杉呈现蓝色的重要原因。而呈现蓝色的针叶树是否都与蜡质有关还有待于进一步探讨。本研究对于探究北美云杉及其他针叶树蓝色呈色机制提供了一定的理论基础。