林业科学  2014, Vol. 50 Issue (11): 36-43   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20141105
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文章信息

盖瑞, 郭小静, 张贞, 王荣, 毛志泉, 陈学森, 吴树敬, 沈向
Ge Rui, Guo Xiaojing, Zhang Zhen, Wang Rong, Mao Zhiquan, Chen Xuesen, Wu Shujing, Shen Xiang
不同花粉对苹果果实中抗坏血酸相关酶活性的影响
Effects of Different Pollens on Ascorbic Acid Related Enzyme Activities in Apple Fruits
林业科学, 2014, 50(11): 36-43
Scientia Silvae Sinicae, 2014, 50(11): 36-43.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20141105

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收稿日期：2014-04-19
修回日期：2014-07-20

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郭小静
张贞
王荣
毛志泉
陈学森
吴树敬
沈向

引用本文
盖瑞, 郭小静, 张贞, 王荣, 毛志泉, 陈学森, 吴树敬, 沈向. 2014. 不同花粉对苹果果实中抗坏血酸相关酶活性的影响[J]. 林业科学, 50(11): 36-43.
Ge Rui, Guo Xiaojing, Zhang Zhen, Wang Rong, Mao Zhiquan, Chen Xuesen, Wu Shujing, Shen Xiang. 2014. Effects of Different Pollens on Ascorbic Acid Related Enzyme Activities in Apple Fruits. Scientia Silvae Sinicae, 50(11): 36-43.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20141105
不同花粉对苹果果实中抗坏血酸相关酶活性的影响
盖瑞, 郭小静, 张贞, 王荣, 毛志泉, 陈学森, 吴树敬, 沈向     
山东农业大学园艺科学与工程学院 作物生物学国家重点实验室 泰安 271018
收稿日期：2014-04-19；修回日期：2014-07-20
基金项目：现代农业产业技术体系建设专项基金(CARS-28)；公益性行业(农业)科研专项经费(201303093)；山东省2013年度农业重大应用技术创新课题(2013-nd-6)；教育部长江学者和创新团队发展计划资助的论文(IRT1155)。
通讯作者：沈向
摘要：采用自育高效授粉树的花粉，在富士、金帅、嘎啦苹果铃铛花期时进行授粉，自授粉后20天的幼果开始间隔20天连续采样，对果实抗坏血酸(AsA)代谢中关键酶抗坏血酸氧化酶(AAO)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)、L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)、L-半乳糖脱氢酶(GalDH)，以及AsA含量进行测定。结果表明：苹果果实AsA的迅速积累期主要为授粉后40~60天期间，用高效授粉树花粉授粉的果实，在整个生长发育过程中，L-半乳糖内酯脱氢酶的活性均比对照果实有明显的提高，对于L-半乳糖脱氢酶，虽然该酶在授粉果实内活性较对照果实有所提高，但其在整个生长发育时期活性比较低；对于处理果实，其还原酶MDHAR和DHAR的活性提高，而氧化酶AAO和APX的活性却较对照果实降低，但总体活性水平差异不显著。AAO，APX，MDHAR，DHAR 4个酶均在果实发育初期存在较高的活性，以后逐渐降低并维持在稳定的水平，后期活性不高。这表明经高效授粉树授粉处理的果实主要是通过提高果实内AsA合成酶的活性来提高果实内AsA的含量。
关键词： 苹果    授粉    抗坏血酸    代谢物    酶活性    
Effects of Different Pollens on Ascorbic Acid Related Enzyme Activities in Apple Fruits
Ge Rui, Guo Xiaojing, Zhang Zhen, Wang Rong, Mao Zhiquan, Chen Xuesen, Wu Shujing, Shen Xiang     
State Key Laboratory of Crop Biology College of Horticultural Science and Engineering, Shandong Agricultural University Tai'an 271018
Abstract: Three apple (Malus domestica) cultivars including Fuji, Gala and Golden Delicious were pollinated before the blooming period with pollens from different pollination trees. The ascorbic acid (AsA) metabolism relative enzymes, including ascorbate oxygenase (AAO), ascorbate peroxidase (APX), dehydroascorbate reductase (DHAR), monodehydroascorbate reductase (MDHAR), L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase (GalLDH), L-galactose dehydrogenase (GalDH), in the fruits were determined every 20 days during fruit development stage. The results showed that AsA contents increased significantly during 40–60 days after pollination. The GalLDH activity of the pollinated fruits was significantly higher than that of the control. The GalDH activity of the pollinated fruits was also higher than that of the control even though the enzyme had relatively low activity during fruit development process. The activity of MDHAR and DHAR in the pollinated fruits was relatively higher than the controls during the fruit development stage, while the activity of AAO and APX in the pollinated fruits was lower than the controls, but there were no significant differences in those enzymes activities between the pollinated fruits and the controls. Besides, the activity of AAO, APX, DHAR, and MDHAR maintained a relatively high level at the early fruit development stage, then declined and finally remained stable at a low level. The study suggests that the increase of the synthetase activity leads to the increase of AsA contents in the pollinated fruit.
Key words: apple    pollination    ascorbic acid    metabolism    enzyme activity    

抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)是植物和大多数动物体内合成的一类己糖内酯化合物，它不仅是维持人体健康的必须物质，而且对植物本身也具有重要的生理功能。AsA在光合作用和代谢调控方面起着重要的作用(郭新波等，2011)，若植物体内AsA不足或代谢受阻，将会导致植物的抗逆性降低(靳月华等，2003)和生长发育受限(Veljovic-Jovanovic et al.，2001)。目前，对植物AsA代谢和水平调控的研究(侯长明等，2009)和刺梨(Rosa roxburghii)果实AsA的代谢机制(安华明等，2005)有较为深入的研究。在高等植物体内，AsA的主要合成途径主要为： D-葡萄糖-6-磷酸→D-果糖-6-磷酸→D-甘露糖-6-磷酸→D-甘露糖-1-磷酸→GDP-D-甘露糖→GDP-L-半乳糖→L-半乳糖- 1-磷酸→L-半乳糖→L-半乳糖内酯→AsA(Lorence et al.，2004)，在该途径中，L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶(GalLDH)能够催化半乳糖内酯直接形成AsA，在AsA合成途径中起着非常关键的作用。而果实内高AsA的积累主要是由于AsA合成途径中的关键酶GalLDH能在果实整个发育时期内长时间保持较高的活性。除此之外，抗坏血酸氧化酶(AAO)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)作为植物体内氧化分解AsA的主要酶，在O2和H2O2的参与下，将AsA氧化为不稳定的单脱氢抗坏血酸并形成DHA，而DHA可在脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)的作用下还原为AsA，从而得以循环再生。因此，在植物体内这4种循环代谢酶的活性也会影响AsA水平的高低。植物细胞中AsA的积累水平主要取决于AsA合成与循环再生两者之间的平衡关系(Ishikawa et al.，2006)。目前，对于高效授粉树花粉对苹果(Malus domestica)果实发育期AsA积累与相关酶活性的影响及其相互关系的研究较少。

我国苹果种植面积和产量分别占世界苹果种植总面积和总产量的47%和51%(范英，2010)，果实品质形成的理论基础与技术方法一直是研究者和生产者关注的焦点。苹果果实AsA代谢是果实品质形成的关键要素(李明军，2009)。如何提高苹果果实内AsA的含量成为提高苹果商品价值的重要因素。前期研究表明，高效授粉树的花粉能提高苹果果实内AsA的含量(董彦等，2012)，而对于高效授粉树花粉是如何提高果实AsA含量的机制还不清楚。本研究通过采样比较经高效授粉树授粉处理后的苹果果实在整个发育过程中AsA积累量与关键酶活性的变化，揭示苹果果实AsA合成过程中关键酶的影响。

1 材料与方法 1.1 试验材料

苹果品种‘嘎啦’(Malus domestica‘Gala’)、‘金帅’(M.domestica ‘Golden Delicious’)、‘富士’(M.domestica ‘Fuji’)均为20年生成龄果树，生长良好，结果正常，位于山东农业大学莱州市金城镇试验基地。花粉为自选育海棠高效授粉树优系1379的花粉，花粉活力强，花粉量充足。

1.2 试验处理

花粉于2013年4月中旬采自山东农业大学观赏果树实验站，于同年5月2日在莱州市金城镇试验基地进行人工授粉，对照授以新红星(M.domestica‘Starking’)苹果品种的花粉。每株随机选取200朵铃铛花进行去雄授粉，每朵花序保留1~2朵花，随后套以无纺布，防止异源花粉的干扰，5天后去除无纺布，以保证其正常的光合和生长发育。以授粉后20天的幼果为试材，每20天采样1次，样品放入冰盒中保存并带回，进行相关指标和酶活性的测定。其中‘嘎啦’和‘金帅’共采样6次，‘富士’采样测定共8次。

1.3 试验方法 1.3.1 单果质量

每次随机取10~15个果实直接称重并计算平均单果质量。

1.3.2 AsA、水溶性总糖与可滴定酸含量

AsA含量采用钼蓝比色法(齐树杰等，2009)测定；可溶性总糖含量参考姚改芳等(2010)的方法测定；可滴定酸含量采用NaOH滴定法(韩雅珊，1992)测定。

1.3.3 GalLDH活性的测定

参考Ôba等(1995)的方法，3 mL反应体系含50 mmol·L-1的Tris-HCl(pH8.0)，0.1%TritonX-100，0.1 mol·L-1的NaN3，0.02 mmol·L-1的cytc，4.5 mmol·L-1的L-半乳糖-1，4内酯以及0.2 mL酶液。测定550 nm处吸光值的变化，以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活力单位，结果以U·min-1g-1FW表示。

1.3.4 L-半乳糖脱氢酶(GalDH)活性的测定

参考Gatzek等(2002)的方法，在1.5 mL 100 mmol·L-1的Tris-HCl(pH8.0)反应体系中含0.5 mmol·L-1的NaD+，1 mmol·L-1的L-半乳糖和0.1 mL酶液。340 nm下测定吸光值的变化，以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活力单位，结果以U·min-1g-1FW表示。

1.3.5 APX，AAO，DHAR，MDHAR活性的测定

APX活性的测定参考Nakano等(1981)的方法，反应体系包含50 μmol·L-1的AsA，90 μmol·L-1的H2O2，50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH6.5)，3 mL反应液中加入0.1 mL酶液后记录单位时间内365 nm下吸光值的变化。

MDHAR和DHAR活性的测定参考Ma等(2003)的方法。DHAR反应体系包含0.2 mmol·L-1的DHA，2.5 mmol·L-1的GSH和100 mmol·L-1的磷酸钾缓冲液(pH6.3)，3 mL反应液中加入0.1 mL酶液后记录单位时间内265 nm下吸光值的变化。MDHAR反应体系包含50 mmol·L-1的磷酸钾缓冲液(pH7.6)，0.1 mmol·L-1的NADH，0.25 mmol·L-1的AsA，0.3U的AO，3 mL体系加入0.1 mL酶液后记录单位时间内340 nm下吸光值的变化。

AAO活性的测定参考Pignocchi等(2003)的方法，反应体系包含0.15 mmol·L-1的AsA，0.5 mmol·L-1的EDTA和50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液(pH7.0)。3 mL反应液中加入0.1 mL酶液后记录单位时间内265 nm处吸光值的变化。以上结果以每分钟吸光值变化0.01为一个酶活力单位，结果以U·min-1g-1FW)表示。

1.4 数据统计与分析

用DPS统计分析软件计算不同处理间所测定指标的平均值和标准差，进行方差分析与相关性回归分析。

2 结果与分析 2.1 果实质量的变化

从表 1中可以看出，自花后20天开始，果实开始迅速膨大，其中嘎啦在100天后单果质量增加速率开始减慢，富士在140天后单果质量增加速率开始明显减慢。在果实发育时期，对于相同品种的经授粉处理的果实和CK来说，处理的果实质量比CK的单果质量小，在最后1次采样测定中，嘎啦、金帅、富士处理果实比CK分别低1.7%，1.8%和2.5%，这表明花粉直感对果实质量有较为显著的影响，这与李保国等(2004)研究相似，其中对富士的影响较大。

表 1 果实生长发育过程中质量的变化① Tab.1 The changes in single fruit weight during fruit development
2.2 果实AsA含量的变化

从表 2看出，在果实生长发育阶段，果实AsA的含量逐渐减少，其中幼果的含量显著高于成熟果实，幼果AsA含量约为成熟果实AsA含量的10~15倍。就不同品种来说，在果实整个发育时期，AsA的含量从高到低依次是富士、嘎啦、金帅；就相同的品种来说，处理果实中AsA的含量在整个果实发育时期均显著高于CK，其嘎啦、富士、金帅成熟时期AsA的含量分别是CK的1.35，1.54和1.12倍。

表 2 果实生长发育过程中AsA含量的变化 Tab.2 The changes of AsA contents during fruit growth and development

就果实生长发育过程中果实AsA的积累量变化(表 3)来说，AsA自花后20天开始迅速积累，在60天时AsA积累量到达最大值。60天后，除处理的嘎啦和金帅果实外，富士果实内AsA的积累量均有显著的降低。相同品种的苹果果实，处理果实内AsA的积累量与CK相比，在果实发育初期积累量较低，但从60天开始，处理果实的AsA积累量已经显著高于CK，富士从80天开始处理果实中AsA积累量开始高于CK。成熟时期，嘎啦、富士、金帅的处理果实中的AsA积累量分别是CK的1.19，1.35和1.04倍。这表明花粉直感对富士苹果AsA含量影响较显著，而对嘎啦和金帅2个品种的果实AsA含量影响不显著。

表 3 果实生长发育过程中AsA积累量变化 Tab.3 The changes of AsA accumulations during fruit growth and development
2.3 果实糖酸含量的变化

从表 4，5中可以看出，在果实成熟时，处理品种的含糖量均比CK含糖量高，富士、嘎啦和金帅在成熟时处理果实的含糖量分别是CK的1.41，1.08，1.38倍，而成熟时处理果实含酸量约是CK的0.65，0.92和0.57。而在果实发育前期，处理果实与CK相比较，处理果实的糖含量较CK低，而可滴定酸的含量却高于CK，可见果实内AsA的含量与果实糖酸含量存在一定的相关性。为进一步阐明果实内AsA含量与果实糖酸含量的关系，分别做了果实糖酸比与AsA含量的相关性分析(图 1~3)。果实AsA含量与糖酸比呈较为显著的二项式关系，在0~60天时，也就是果实AsA迅速积累的时期，果实内AsA的含量与糖酸比呈显著的负相关关系，富士在0~80天时果实AsA含量与糖酸比呈较明显的负相关关系。在60天后，果实内AsA积累趋于稳定，此时果实内AsA的含量与糖酸比的关系不显著。

表 4 果实生长发育过程中可溶性糖含量的变化 Tab.4 The changes of soluble sugar contents during fruit growth and development
表 5 果实生长发育过程中可滴定酸含量的变化 Tab.5 The changes of Titratable acid contents during fruit growth and development
图 1 嘎啦果实糖酸比与AsA含量的相关性 Fig. 1 Correlation between sugar and acid ratio and the content of AsA in Gala
图 2 金帅果实糖酸比与AsA含量的相关性 Fig. 2 Correlation between sugar and acid ratio and the contents of AsA in Golden Delicious
图 3 富士果实糖酸比与AsA含量的相关性 Fig. 3 Correlation between sugar and acid ratio and the contents of AsA in Fuji
2.4 AsA合成过程中关键酶活性的变化 2.4.1 GalLDH活性的变化

GalLDH活性(表 6)在整个果实生长发育时期均可以被检测到，在果实发育初期便存在较高的活性。在果实发育过程中，自40~60天开始，GalLDH的活性开始迅速增加，到60天时活性到达最大值，此时AsA的积累量也到达最大值。自60天以后，GalLDH的活性开始下降，之后趋于平缓，直至果实成熟。从总体上看，苹果果实中AsA的积累与GalLDH活性的变化趋势是基本一致的。通过GalLDH在40天和60天活性的柱状图(图 4、5)可以发现，60天时该酶在处理果实嘎啦、富士、金帅中的活性分别是40天时处理果实活性的4.1，3.1和2.9倍。而且该酶在富士内的活性较高，在嘎啦和金帅内活性没有显著差异。就3个不同的品种看来，在60天酶活性最高时，嘎啦、金帅、富士的处理果实酶活性分别是CK的1.35，1.19和1.14倍。就相同品种来说，在果实整个发育时期授粉果实内GalLDH活性均比CK高，这也与果实AsA的积累量变化保持一致。

表 6 果实生长发育过程中GalLDH活性的变化 Tab.6 The activity changes of GalLDH during fruit growth and development
图 4 40天时GalLDH活性 Fig. 4 The activity of GalLDH on the 40th day
图 5 60天时GalLDH活性 Fig. 5 The activity of GalLDH on the 60th day
2.4.2 GalDH活性的变化

从表 7可以看出，GalDH的活性在果实整个发育时期内均比较低，在果实成熟时期时已基本检测不到该酶的活性。在果实整个发育时期内，GalDH活性在果实发育初期活性较高，这也是果实内AsA含量迅速积累的时期，之后该酶的活性开始下降并维持在一个较低的水平。总体来看，GalDH在整个果实发育时期内活性的变化趋势基本与AsA积累量变化趋势相似。对于相同品种间处理的果实和CK相比较，处理的果实中酶活性要高于CK，但是差异性不显著而且酶活性的水平也比较低。

表 7 果实生长发育过程中GalDH活性的变化 Tab.7 The activity changes of GalDH during fruit growth and development
2.4.3 AAO，APX，DHAR，MDHAR活性的变化

在果实整个生长发育时期，APX(表 8)和AAO(表 9)活性整体呈下降趋势。在果实发育前期，果实中APX和AAO的活性较高，在20~60天时期内这2个氧化酶的活性迅速降低。其中APX活性在80天时达到最低值，AAO活性在60天时达到最低值，此时期也是果实内AsA迅速积累的时期。之后这2个氧化酶的活性一直维持在较低的水平并保持稳定，其中AAO的活性在60天后略有升高，富士品种在120天后AAO活性下降并趋于零。就相同品种来说，AAO和APX这2个氧化酶的活性总体上在处理果实内活性水平低于CK。80天时，嘎啦、富士、金帅处理果实中APX的活性分别是CK的0.98，0.48和0.82。60天时，嘎啦、金帅、富士处理果实中AAO的活性分别是CK的0.68，0.91和0.78。DHAR(表 10)和MDHAR(表 11)2个酶的活性在果实整个发育时期总体上活性是逐渐下降，在经过果实AsA迅速积累的时期后，也就是在60天后，这2个酶活性下降较为明显，之后维持在较低的水平，其中DHAR的活性在果实发育后期已经基本检测不到。而且就相同的品种而言，处理的果实内这2个还原酶的活性要高于CK，但差异性不显著。

表 8 果实生长发育过程中APX活性的变化 Tab.8 The activity changes of APX during fruit growth and development
表 9 果实生长发育过程中AAO活性的变化 Tab.9 The activity changes of AAO during fruit growth and development
表 10 果实生长发育过程中DHAR活性的变化 Tab.10 The activity changes of DHAR during fruit growth and development
表 11 果实生长发育过程中MDHAR活性的变化 Tab.11 The activity changes of MDHAR during fruit growth and development
3 讨论

对高等植物AsA的合成途径研究表明，目前存在4种AsA生物合成可能的途径(安华明等，2004)，其中，L-半乳糖途径是公认的高等植物体内AsA合成的主要途径。作为在L-半乳糖途径中的关键酶GalLDH，它的有无是植物是否能自身合成AsA的前提(Hancock et al.，2005)，其活性变化与AsA积累量之间存在着较为明显的正相关关系，在果实中AsA的积累很大程度上受GalLDH活性的调节(安华明等，2005)。在本研究中，果实AsA的积累量在20~60天内迅速升高，而在60天后则维持稳定，这与Hancock等(2007)在黑茶蔗子(Ribes nigrum)果实的AsA积累特点相似。其AsA关键合成酶GalLDH的活性在40~60天内迅速升高，在60天时达到最大值，这与果实在发育过程中AsA积累量的变化趋势基本一致。而对于处理的果实而言，其果实内的GalLDH活性在整个发育时期较CK有较显著的升高，这表明处理果实内AsA含量升高与GalLDH活性的提高有密切的关系。

作为L-半乳糖途径中的另一个酶GalDH，是AsA合成的相关酶中仅参与了AsA合成的酶(Linster et al.，2008)，它能够直接在C1位氧化L-半乳糖形成AsA生成的直接底物L-半乳糖- 1，4-内酯，其表达量的变化直接影响AsA含量，是AsA生物合成的关键限速酶之一(尚增振等，2009)。在本研究中，GalDH活性在40~60天时有显著的升高，此后其活性逐渐降低并趋于零，GalDH活性在60天时的变化与GalLDH活性变化相似，且经过授粉处理后的果实其酶的活性较CK有所提高，促进L-半乳糖-1，4-内酯的生成，也间接提高了处理果实内AsA的含量。

AsA水平除受合成影响外，还受循环再生途径影响。在循环再生过程中，植物体内主要是由AAO和APX催化AsA的氧化分解，并且二者均与表示AsA氧化程度的AsA/DHA比值表现出显著的负相关(Stasolla et al.，2001)。这2种酶分别在O2和H2O2的作用下将AsA氧化为较不稳定的MDHA(Noctor et al.，1998)，再经过非酶歧化反应形成DHA，其中，DHA在DHAR和MDHAR的作用下还原为AsA，从而得以循环再生(Davey et al.，2000)。在本研究中发现，氧化AsA的酶AAO和APX以及还原酶DHAR和MDHAR在果实生长初期均有较高的活性，随后开始迅速降低，在60天后这4个酶的活性基本维持在较低的水平，这表明在这一时间段内果实内积累的AsA极少被氧化，从而保证果实体内AsA的迅速积累。而在处理果实和CK之间的活性水平差异不显著。

果实内AsA的水平主要受合成和循环代谢二者间的影响。经高效授粉树授粉的果实，果实内合成酶GalLDH和GalDH的活性有显著的提高，而在AsA循环代谢途径中，在果实发育初期处理果实内的氧化酶AAO和APX活性降低，还原酶DHAR和MDHAR的活性升高，但差异不显著。这表明果实内的AsA积累主要来源于合成，而参与循环代谢的氧化酶AAO，APX和还原酶DHAR，MDHAR对AsA含量水平的影响不起主要作用。由此可见，经处理后的果实内AsA含量显著提高的原因主要是由于高效授粉树花粉的应用显著提高AsA合成关键酶的活性，从而促进了AsA的合成。

高效授粉树花粉的应用还能改变果实内糖酸的含量，起到增糖降酸的作用，从而改善果实品质。在果实整个发育时期，果实内AsA含量与果实内糖酸比呈较显著的二项式关系，即在果实AsA迅速积累的时期，果实内AsA含量与糖酸比呈显著的负相关系；而在果实发育后期则没有显著的相关关系。除此之外，高效授粉树花粉的应用还能够增加果实硬度，改善口感(董彦等，2012)。由此可见，同属异种间的授粉可以对苹果作为功能性食品的研发具有一定的促进作用。

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