茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其挥发性甲酯衍生物茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是重要的植物生长调节剂，在植物生长过程中起整体性调控作用，具有广泛的生理效应。一方面JA可以调节植物的生长发育，如种子的萌发与生长(Anderson，1988)、器官的生长发育(Meyer et al.，1984)、植物的衰老与死亡(Reinbothe et al.，2009)及光合作用(Metodiev et al.，1996)等;另一方面JA还参与对生物胁迫和非生物胁迫的防御反应(Wasternack et al.，2002)，如机械创伤(Creelman et al.，1992;Stenzel et al.，2003a)、病原菌侵染(Parthier，1990)、逆境胁迫(Tsonev et al.，1998)等。因而，植物体内JA含量影响植物的发育及对逆境的抗性。在植物体内，JA是以亚麻酸(或亚油酸)为底物经过一系列酶促反应合成的(Stenzel et al.，2003b)。丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase，AOC)是JA合成中的关键酶，其活性对于代谢中间产物最终转化成茉莉酸产物至关重要(Schaller，2001)。该酶能够特异性地环化催化丙二烯氧化物[12，13(S)-epoxylin-olenicacid]并生成茉莉酸产物的前体———1，2-氧-植物二烯酸[(9S，13S)-12-oxo-(10，15Z)-phytodienoicacid，OPDA](Creelman et al.，1997)，被认为是茉莉酸生物合成中最为关键的一步反应(蒋科技等，2010)。因而分离丙二烯氧化物环化酶的编码基因并分析其表达对于理解其在植物生长发育和逆境胁迫中发挥的作用具有积极意义。

最早的AOC蛋白是从玉米(Zea mays)中分离出来的，分子质量约为45 kDa，其活性能被(+/-)-顺-12，13-环氧-9(Z)-十八碳烯酸和(+/-)-顺-12，13-环氧-9(Z)，15(Z)-十八碳烯酸所抑制(Hamberg et al.，1990)。Ziegler等(1997;2000)首次从番茄(Solanum lycopersicum)中克隆得到AOC基因，并分析了AOC酶底物的特异性和亚细胞定位，发现它是叶绿体蛋白。Hofmann等(2006)报道了拟南芥(Arabidopsis thaliana)AOC2蛋白的晶体结构。有研究显示在细菌中表达的红树(Rhizophora apiculata)和喜树(Camptothecaacuminata)AOC基因，显示出很好的耐盐作用(Yamada et al.，2002;Pi et al.，2008)，这表明AOC基因具有潜在的提高植物抗逆性的能力。

本试验通过电子克隆和RACE技术相结合的方法克隆了苹果(Malus domestica)AOC基因，并利用实时荧光定量PCR技术分析了该基因在不同组织中的表达，以及其对机械伤和外源激素处理的响应，旨在探索苹果AOC基因与植物抗逆性之间的关系。

以通过茎尖培养获得的苹果‘嘎拉’组培苗进行试验，将组培苗诱导生根，所用生根培养基为(1/2MS+0.5 mg·L^-1 IBA+30 g·L^-1蔗糖+7g·L^-1琼脂，pH 5.8)(Yao et al.，1995)，暗培养1周，光下培养3周后进行处理。

1)伤处理:用刀片迅速将组培苗叶片划伤，在伤害处理后0，2，4，8，12 h取处理过的叶片，迅速置于液氮中冷冻，-70 ℃保存备用。每个时间点处理3株苗作为1个混合样品，重复3次。

2)MeJA和SA处理:分别用0.1 mmol·L^-1MeJA(Sigma)、 0.1 mmol·L^-1 SA(Sigma)喷洒于苹果‘嘎拉’组培苗的叶片表面，分别于0，2，4，8，12，48 h后取其叶片，迅速置于液氮中冷冻，-70 ℃保存备用。每个时间点处理3株苗作为1个混合样品，重复3次。

用BLASTp算法以水稻(Oryza sativa)AOC蛋白的氨基酸序列为搜索项搜索苹果基因组数据库(http://www.rosaceae.org/)，以获得苹果AOC基因家族的序列。在对苹果AOC基因家族分析的基础上，克隆MdAOC1基因。根据获得的基因组上MdAOC1基因序列设计引物，分别为MdAOC1-F1:5'-ATGGCGTCTGCAAGCTCTCT-3'，MdAOC1-R1: 5'-ATCCTTAATGCCCTTCAAAT-3'。并结合3'RACE技术，获得全长cDNA片段。3'RACE技术参照柏素花等(2012)的方法，所用引物为MdAOC1-F2: 5'-TTATCTGACCTACGAGGACACG-3'，MdAOC1-R2:5'-GTTCAGTCCGACTAGTCATG-3'。总RNA采用原平皓(天津)生物技术有限公司EASYspin植物RNA快速提取试剂盒从苹果‘嘎拉’的幼叶中提取。cDNA用Fermentas公司的RevertAid ^TM First Str and cDNA synthesis Kit试剂盒合成。胶回收用TaKaRa公司的MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit进行，回收产物连接到载体pMD18-T(TaKaRa)上，转化至大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆测序。

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi网站上分析基因开放阅读框;在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/网站上分析氨基酸的同源性和功能保守区域;用MEGA 5.0软件，邻接法(Neighourjoining)构建系统进化树，所用模型为泊松模型，bootstrap值为1 000;在http://www.expasy.ch/tools/protparam. html网站上对蛋白质的理化性质进行分析;叶绿体前导肽的预测在http://www.cbs.dtu.dk/services/Chlorop网站上进行(Emanuelsson et al.，1999);利用SWISS MODEL构建蛋白质的三级结构模型(http://swissmodel.expasy.org/)。在http://www.rosaceae.org/数据库中预测AOC蛋白家族的所有基因。

用实时荧光定量PCR方法进行基因表达定量分析。分别以‘嘎拉’苹果的茎、叶、花、果实、芽的总RNA为模板进行反转录。每种组织从12株苹果树上取样，从3株树上取得的混样作为1个组织样品，共重复4次。荧光定量PCR在罗氏LightCycler480Ⅱ仪器上用TaKaRa公司的SYBR^® Premix ExTaq TM试剂盒进行。所用MdAOC1的引物为MdAOC1-F3: 5'-TCAGTCTCTCTCGCTCCTTCC-3'和MdAOC1-R3: 5'-CTTGAACTTTTGTGGGTCGTG-3'，内参基因β-actin的引物为5'-CTGAACCCAAAGGCTAATCG-3'和5'-ACTGGCGTAGAGGGAAAGAA-3'(GQ339778.1)。荧光定量PCR体系含SYBR^® Premix Ex Taq^TM(2×)染料10.0 μL，上下游引物各0.8 μL(10 μmol·L^-1)，cDNA模板1.0 μL(150 ng·μL^-1)，ddH₂O 7.4 μL。扩增反应程序为95 ℃ 30 s预变性;95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，扩增40个循环。循环结束后进行熔解曲线分析。

数据分析利用2^-ΔΔC_T方法(Livak et al.，2001)进行。在组织表达分析中用表达量最低的组织作为校正子，在胁迫处理的表达分析中用未处理的样品作为校正子。所有的数据都以相对mRNA表达量表示，数据统计用SPSS软件进行单因素方差分析和Duncan's检验。

为探讨AOC基因在苹果植物抵抗逆境胁迫过程中的作用，首先克隆了MdAOC1基因并对其表达进行了分析。以苹果幼叶cDNA为模板进行PCR扩增，获得苹果AOC基因972 bp的全长cDNA序列。此序列包括759 bp的开放阅读框，编码252个氨基酸(图 1)。该氨基酸序列包含1个保守的Allene_ox_cyc结构域，并带有1个61氨基酸长的N-末端叶绿体前导肽。成熟蛋白分子质量为21.151 kDa，等电点为8.47。以水稻AOC蛋白为搜索项，利用Blastp算法搜索苹果基因组多肽数据库(http://www.rosaceae.org/)，鉴定苹果基因组中AOC蛋白的编码序列。发现苹果基因组中共有5个推定的AOC基因，分别命名为MdAOC1(MDP0000469813)，MdAOC2(MDP0000180004)，MdAOC3(MDP0000319795)，MdAOC4(MDP0000299876)，MdAOC5(MDP0000752143)。这5个基因编码的蛋白序列在保守区具有高度的序列相似性，均包含有Allene_ox_cyc结构域，除MdAOC3外，另外4个MdAOC蛋白都在N端含有61～76个氨基酸残基的叶绿体前导肽。但与其他AOC蛋白相比，MdAOC4和MdAOC5缺少半胱氨酸活性位点，其他3个蛋白MdAOC1、MdAOC2和MdAOC3均具有活性位点的保守氨基酸(图 2)。

	图 1 MdAOC1基因的cDNA及氨基酸序列 Fig. 1 cDNA sequence of MdAOC1 and its deduced amino acid sequence * 代表终止密码子，□表示叶绿体前导肽，阴影部分表示 Allene_ox_cyc 结构域。 * indicates the termination codon，the predicted N-terminal chloroplast transit peptide( cTP) is boxed，and the Allene_ox_cyc domain is shown by gray background．

图 2 MdAOC1与其他植物AOC氨基酸序列的多重比对 Fig. 2 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of MdAOC1 protein and AOCs proteins from other species 黑色背景的白色字母表示一致的氨基酸，灰色背景字母表示相似的氨基酸，星号表示活性位点的保守氨基酸残基，箭头表示8个β延伸链。蛋白名称、来源物种及序列号如下: AtAOC1(拟南芥，Q9LS03.1);AtAOC2(拟南芥，Q9LS02.1);AtAOC3(拟南芥，Q9LS01.1);AtAOC4(拟南芥，Q93ZC5.1);OsAOC(水稻，Q711Q9)。 Identical amino acids are in white letters with black background，and grey background indicate similar amino acid． The asterisks(*)indicateconserved amino acid residues corresponding to active site，and the arrows indicate 8 β-Strands． The accession numbers of the proteins used inalignment are listed as following: AtAOC1(A． thaliana，Q9LS03.1);AtAOC2(Arabidopsis thaliana，Q9LS02.1);AtAOC3(A． thaliana，Q9LS01.1);AtAOC4(A． thaliana，Q93ZC5.1);OsAOC(Oryza sativa，Q711Q9)．

多重序列比对显示，与其他的植物AOC相比，MdAOC1的氨基酸序列在C端相对保守，而在N端和序列长度上则呈现多样性，但也与其他植物的AOC蛋白存在共同特征，在N端都富含羟基化的氨基酸(丝氨酸和苏氨酸)，有很少的酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)，并且有相对保守的甲硫氨酰-丙氨酸这一多肽，这些特点利于蛋白穿出叶绿体并被多肽酶裂解(Wu，2011)。Allene_ox_cyc结构域在不同物种中具有高度保守性，特别是与拟南芥AOC蛋白的8个β延伸链(β-Str and s)的对应位置更是如此，其活性位点的保守氨基酸Glu-92，Ser-100，Asn-94，Asn-122，Pro-101和Cys-140同样存在于苹果AOC蛋白中(图 2)。

Blast分析发现MdAOC1蛋白与碧桃(Prunuspersica)的AOC蛋白(EMJ24919.1)的一致性最高为84%，与烟草(Nicotiana tabacum)(CAC83765)、水稻(AFP87550)、葡萄(Vitis vinifera)(XP_003633753)、大豆(Glycine max)(AEE99197)、番茄(NP _001234019)、玉米(NP _ 001105245)和拟南芥AtAOC4(At1g13280)的AOC蛋白一致性分别为67%，75%，73%，73%，75%，74%和73%，表明MdAOC1蛋白确实为AOC家族的成员。

为研究MdAOC1在AOC家族中的进化位置，确证MdAOC1蛋白与其他植物蛋白之间的相互关系，利用GDR数据库搜索到苹果AOC家族的所有氨基酸序列，并与拟南芥、水稻、玉米、大豆等植物的所有AOC家族的氨基酸序列用邻接法聚类。发现AOC家族的蛋白可明显分为3大类:苹果与大豆AOC家族聚类在一个群中，水稻、玉米等单子叶植物为一个类群，而拟南芥AOC家族单独为一个群。此聚类结果显示，各物种AOC家族的蛋白之间的保守区没有明显结构上的分类，都属于同一类蛋白，暗示同一物种的蛋白可能具有相似的功能(图 3)。

	图 3 不同物种的AOC蛋白的聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of AOC protein derived from different species

为了更好地分析MdAOC1蛋白与结构之间的关系，借助生物学软件SWISS MODEL构建了MdAOC1蛋白三维结构模型(图 4)。MdAOC1蛋白形成了一个由3条链组成的疏水结合空穴，同时具有2个不同的极性patch，此为AOC蛋白家族的一个重要特征。结合图 2与其他植物的AOC蛋白序列的比对，发现AOC蛋白形成了一个桶状的结合空穴，富有芳香和疏水残基，包括活性位点的保守氨基酸残基Glu-92，Ser-100，Asn-94，Asn-122，Pro-101和Cys-140，其排布方式与拟南芥AtAOC2(AT3 G25770)蛋白的晶体结构(Hofmann，2006)相似，暗示其具有与AtAOC2相似的功能。

	图 4 SWISS-MODEL预测的MdAOC1三维结构模型 Fig. 4 The tertiary structure of MdAOC1 predicted with SWISS-MODEL A: AtAOC2; B: MdAOC1．

通过荧光定量PCR检测MdAOC1在苹果不同组织中的表达情况(图 5)，MdAOC1在茎、叶、花、果实和芽中均有表达，但在茎中的相对表达量最高，在叶中的表达量很低，具有较明显的组织特异性。

	图 5 苹果不同组织中MdAOC1的表达 Fig. 5 Expression of MdAOC1 in different tissues of apple

在以前的报道中，AOC被认为是虫咬伤诱导的蛋白(Stenzel et al.，2003a)。为分析MdAOC1基因的表达是否响应害虫造成的损伤处理，用机械损伤处理‘嘎拉’苹果组培苗叶片，发现机械损伤处理后2 h MdAOC1基因表达迅速升高并达到最高水平，为对照的14.38倍(P ＜ 0.05)，以后逐渐降低，12 h后基本回复到对照水平(图 6A)。

	图 6 损伤或植物激素处理后苹果MdAOC1时序表达 Fig. 6 Temporal expression of MdAOC1 after wounding or phytohormone treatment

用0.1 mmol·L^-1外源MeJA处理苹果组培苗叶片，发现MdAOC1基因的表达能被MeJA诱导，处理后4 h达到峰值，表达量约为对照的5.6倍(P ＜0.05)，后又逐渐降低，在24 h已基本回复到对照水平(图 6B)。

SA途径和JA途径相互作用，在一定浓度范围内相互制约。为探索外源SA对MdAOC1基因的可能影响，用0.1 mmol·L^-1 SA处理苹果组培苗叶片，并于不同的时间取样测定基因的表达。结果显示SA处理2 h，MdAOC1在叶中的表达先是显著提高至对照的8.3倍(P ＜ 0.05)，而后在4 h又降低至对照水平的50%(P ＜ 0.05)，到8 h为对照水平的1.5倍(P ＜ 0.05)，以后又回复到对照水平(图 6C)。

茉莉酸广泛存在于植物的幼嫩组织和发育的生殖器官中(Laudert et al.，1998)，并通过信号转导来调控植物生长发育和应激反应。AOC是JA合成的关键酶，是一个多基因家族，该家族的基因具有不同的功能，参与不同的生理途径。本研究在分析苹果基因组AOC基因组成的基础上，对MdAOC1基因的结构及表达进行了分析。结果显示MdAOC1基因编码一个由252个氨基酸组成的蛋白，该蛋白与水稻、拟南芥等植物的AOC蛋白氨基酸序列具有高度相似性;其三级结构模型是一个由3条链组成的疏水结合空穴，同拟南芥AtAOC2的蛋白结构相似。MdAOC1基因主要在茎中表达;不仅能被机械伤所诱导，还能被外源激素MeJA、 SA处理所诱导。

不同的AOC在不同的组织有不同的表达模式，拟南芥AtAOC1和AtAOC2在植物的叶中表达很高，AtAOC3在花组织中大量表达，而AtAOC4则主要在根中表达(Stenzel et al.，2012)。大豆的6个AOC基因中，GmAOC1和GmAOC2在根中表达量高，GmAOC5和GmAOC6在茎中表达量最高，GmAOC3在根、叶、花中表达量都很高，而GmAOC4则在各组织中表达量均很低(Wu et al.，2011)。本试验中MdAOC1在所检测的组织中均有表达，其中在茎中的表达量最高，暗示MdAOC1可能参与了多种生理过程。

茉莉酸(JA)是一种通过韧皮部筛管长距离运输的信号物质，并在伤信号转导途径中起重要作用(Shan et al.，2007)。大约95%伤诱导的有关蛋白在没有JA的条件下都会下调表达(Gfeller et al.，2011)。本研究中机械损伤能迅速诱导MdAOC1基因的表达，在2 h即达到高峰，表明MdAOC1基因参与了损伤诱导的JA合成。在许多双子叶植物中，例如番茄和烟草，在机械伤害处理后，会发生“茉莉酸突发”现象，即JA含量迅速升高。这种JA积累一方面可能是由于在伤害早期，JA在植物体内快速调运并重新分布运输所造成的，另一方面可能来源于AOC基因参与的JA的从头合成(Ziegler et al.，2000;刘艳等，2008)，但并非所有AOC基因家族的基因均参与损伤诱导的JA合成。本研究结果显示，在苹果AOC基因家族中至少MdAOC1基因参与了伤诱导JA合成。

水杨酸(SA)信号途径和JA信号途径被认为是相互拮抗的2条信号转导途径，逆境胁迫而导致JA的积累在很多植物中可以被SA所抑制(PenaCortés，1993)，因此SA一直被认为可以抑制JA的生物合成，而且许多试验支持了这一结论:如由SA诱导的喜树AOC基因表达量比对照水平低(Pi et al.，2008)，在番茄上也得到同样的结果(PenaCortés et al.，1993)。本研究中用外源SA处理并不抑制MdAOC1基因的表达，相反在SA处理后MdAOC1基因的表达有一个短时间升高。同样的现象也出现在其他植物上，如高粱(Sorghum bicolor)和药用植物莨宕(Hyoscyamus niger)经过SA处理后AOC的表达被显著提高(Salzman et al.，2005;蒋科技，2007);SA处理不能抑制水稻AOC基因的表达(Agrawal et al.，2003;Ziegler et al.，2000);在玉米中SA不但不抑制AOC的表达，反而会刺激依赖AOC活性的OPDA的增加(Ziegler et al.，1997);用SA处理后的拟南芥也会引起OPDA水平的提高(Laudert et al.，1998)。这种在不同植物中SA对JA合成不同的影响可能是在不同物种中SA调节机制的差异造成的。在有些植物中，经过SA处理的组织可能因为消耗JA的速度太快而检测不到JA的积累，而在另一些植物中则可能不然。MdAOC1基因受SA处理诱导，并不等于苹果的其他AOC基因也同样受SA诱导，可能苹果的不同AOC基因具有不同的表达调控机制。苹果的其他AOC基因的表达调节还需要进一步的研究。

JA合成是受正反馈机制调节的合成反应，有报道指出所有的JA合成酶均受JA的正反馈调节，而且只受外源的JA激素诱导而不受内源的JA激素诱导(Turner et al.，2002)。本研究结果显示茉莉酸甲酯(MeJA)能显著诱导MdAOC1基因表达。此结果与前人在大麦(Hordeum vulgare)(Ortel et al.，1999;Maucher et al.，2000)、水稻(Agrawal et al.，2003)、拟南芥(Sasaki et al.，2001;Stenzel et al.，2003b)等植物的研究结果相似。JA作为整个反应的最终产物诱导JA合成酶AOC，MdAOC1基因在MeJA处理4 h达到峰值，而后逐渐降至对照水平。这说明外源JA对MdAOC1蛋白的刺激是短暂的，非持久性影响，可能过多的JA积累触发了植物体内自我保护机制，抑制MdAOC1的持续表达。