Ca²⁺是一种大量元素，它不但在维持细胞壁、细胞膜等植物细胞结构的稳定性以及膜结合蛋白的稳定性中有重要的作用(Hepler，2005)，而且在植物细胞分裂、细胞壁形成、细胞极性的形成、细胞的生长和分化，以及细胞的程序性死亡等过程中起着重要的调节功能(White et al., 2003)。研究发现：Ca²⁺作为植物细胞内的第二信使即充当传递胞外信号的作用(Poovaiah et al., 1987a；1987b)在植物的生长发育以及对生物和非生物逆境胁迫的响应起着重要作用(Bush et al., 1995；McAinsh et al., 2009；DeFalco et al., 2010)，而且由于在已经发现几乎所有的信号(如生长、激素、胁迫方面)都会引起细胞质Ca²⁺分布的变化或引起细胞核和细胞器Ca²⁺分布的变化(Reddy et al., 2011)，因此认为在高等植物响应逆境机理的研究中发现Ca²⁺与植物的抗逆性密切相关，植物在正常生长条件下，液泡是植物细胞的主要Ca²⁺库，细胞外间隙中也存在着大量的Ca²⁺，而胞基质中Ca²⁺的浓度很低(Jian et al., 2000)。当植物细胞受到低温胁迫时，从质外体经质膜或从胞内Ca²⁺库流向胞质的Ca²⁺大量增加，使胞质中Ca²⁺浓度提高。通过胞质Ca²⁺浓度变化将外界的低温胁迫信息传入细胞内，导致细胞发生相应的生理生化响应以抵御低温胁迫(Rasmussed et al., 1984；Somly et al., 1984；Kauss et al., 1987；龚明等，1990；Prasad，1997)。另外，对钙信号研究表明：Ca²⁺准确传递各种复杂信号不仅仅是依靠简单的浓度波动，还与Ca²⁺信号的“时空性”密切相关(Zong et al., 2001；Chang et al., 2005)。

有关低温引起植物细胞内Ca²⁺分布变化的研究大多集中在一年生的草本植物上(王红等，1994；雷江丽等，2000)，而对多年生的常绿阔叶木本植物则研究较少。北海道黄杨(Euonymus japonicus cv. ‘CuZhi’)是由中国林业科学院陶东岱从日本引进，并交由傅紫芰繁殖保存，对低温、盐、有害气体等逆境具有较强的抗性；另外，由于木本植物采取的抗寒策略不同于草本植物，特别是作为能在北方冬季露天过冬的常绿阔叶木本植物极度抗寒的机制更值得深入研究。本试验在前期对一些常绿阔叶木本植物叶肉细胞在低温胁迫过程中超微结构变化观察的基础上(葛秀秀等，2010)，采用焦锑酸钙沉淀法，通过在透射电子显微镜下观察露天越冬的北海道黄杨叶肉细胞内Ca²⁺的动态变化，研究北海道黄杨冷响应的细胞学机制，为林木树种的抗寒性驯化和扩大常绿阔叶木本种植范围等研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

从2010年11月—翌年1月，每月上旬以及2011年6月上旬选取种植于北京市昌平区北京农学院内露天栽培的北海道黄杨当年生枝条上生长健康的叶片进行试验。

1.2 试验方法

取清洗干净的叶片，在叶中脉至叶缘约1/2处剪取面积为0.5 mm×0.5 mm的叶片小块；把叶片小块迅速投入用2%焦锑酸钾(pH 7.6，用100 mmol·L^-1 pH 7.1的磷酸缓冲液配制)配制的3%戊二醛中，室温下固定48 h。之后用含2%焦锑酸钾的磷酸缓冲液(pH7.6)洗涤4次，每次约0.5 h。将洗涤过的小叶片块转移至用含2%焦锑酸钾的缓冲液(pH 7.6)配制的1%锇酸中，室温固定3 h；然后先用重蒸水洗涤4次，再用pH10.0的重蒸水(用0.1 mol·L^-1 KOH调节pH值)洗涤2次，每次约0.5 h。随后经30%，50%，70%，80%，90%，95%系列乙醇脱水各0.5 h，100%乙醇处理2次，每次0.5 h，最后用丙酮置换3次，每次7~15 min。把脱水后的小叶片块放入用丙酮稀释的812环氧树脂(比例为3：1)中，在35 ℃恒温箱中渗透1天，最后用812环氧树脂进行包埋。在37 ℃恒温箱聚合12 h后，继续在45 ℃下聚合24 h；在60 ℃下继续聚合48 h(王红等，1994)。

聚合好的包埋块经过修整，用Leica EMUC7型超薄切片机切片，切片经醋酸双氧铀染色，在Hitachi-7600型透射电子显微镜下观察照相。将在电镜下已确定有焦锑酸钙沉淀的定位切片漂浮在100 mmol·L^-1的EGTA(pH 8.0)溶液中，60 ℃处理0.5~1 h，使EGTA与Ca²⁺鳌合，脱去原沉淀中的Ca²⁺再置于电镜下观察照相。

2 结果与分析 2.1 6月份叶肉细胞Ca²⁺的分布

由图版Ⅰ可知：在6月份夏季正常生长条件下，北海道黄杨叶肉细胞的细胞壁清晰；质膜结构完整；细胞核双层核膜结构完整，核仁清晰；叶绿体沿着质膜排列分布(图版Ⅰ-A)，叶绿体为梭形或椭圆形，类囊体基粒和片层排列整齐，大多数叶绿体内都含有1个淀粉粒(图版Ⅰ-C)，叶绿体间质片层之间有一些嗜锇颗粒(图版Ⅰ-D)；线粒体呈椭圆形或圆形，膜结构完整，内脊清晰可见(图版Ⅰ-F)。叶肉细胞中央有1个明显的中央大液泡，(图版Ⅰ-A)。这时期Ca²⁺主要分布在叶肉细胞的大液泡中(图版Ⅰ-A，B)，而且Ca²⁺沉淀颗粒呈小颗粒或针状分散存在。在叶肉细胞间隙内也经常有Ca²⁺沉淀颗粒(图版Ⅰ-C，D)。另外，在叶绿体、质膜上也有少量的Ca²⁺分布(图版Ⅰ-D)。但在细胞质中没有观察到Ca²⁺的分布(图版Ⅰ-E)。

2.2 11月份叶肉细胞Ca²⁺的分布

北京11月份平均气温是5.5 ℃，这时北海道黄杨叶肉细胞中大多数细胞器形态结构正常，排列有序，细胞壁和质膜结构正常(图版Ⅱ-A)。与夏季6月份生长的叶肉细胞相比较，虽然叶绿体的双层膜结构完整，但叶绿体已出现轻微的肿胀变形，内部片层的排列方向也发生弯曲，大多数叶绿体内的淀粉粒消失，而嗜锇颗粒增加(图版Ⅱ-B，E)，有时数个叶绿体聚集在一起(图版Ⅱ-C)；大多数线粒体仍保持正常的结构(图版Ⅱ-D)；叶肉细胞的中央大液泡结构完整，有些液泡的膜出现内突的现象(图版Ⅱ-F)。

在11月份的叶肉细胞间隙中存在大量的Ca²⁺沉淀颗粒，这些沉淀颗粒较大，并且这些Ca²⁺沉淀颗粒往往聚集在一起(图版Ⅱ-A，B)。在细胞壁上沿着质膜外面形成整齐一圈的Ca²⁺沉淀颗粒，且颗粒数量多、体积明显较大(图版Ⅱ-C)。在质膜的内侧也有Ca²⁺均匀分布(图版Ⅱ-C)。叶绿体的被膜外侧也形成少量的Ca²⁺沉淀(图版Ⅱ-C)。Ca²⁺在液泡内的分布比较集中，形成了较大的Ca²⁺沉淀颗粒，还有很多沉淀颗粒趋向液泡膜的内侧(图版Ⅱ-A，箭头所示)。另外，细胞质中也有Ca²⁺沉淀颗粒(图版Ⅱ-A，D)。

2.3 12月份叶肉细胞Ca²⁺的分布

北京12月份的平均气温是-2.1 ℃，这一时期的植物处于抗寒锻炼的过程中。这时叶肉细胞结构依然比较清晰，质膜、细胞壁和细胞核结构完整(图版Ⅲ-A)。但与11月份的叶肉细胞相比，叶绿体进一步膨胀，有的叶绿体已经明显变成圆形，基粒类囊体和基质类囊体排列不规则，叶绿体类囊体垛叠程度很低，片层数量减少，呈疏松状并行分布，片层间积累大量的嗜锇颗粒，叶绿体内没有淀粉粒(图版Ⅲ-A，B，F)。在叶绿体的周围和沿着质膜的内侧有很多线粒体存在，线粒体结构没有明显变化。这时叶肉细胞的大液泡转变成数个小液泡(图版Ⅲ-A，B，D)，液泡膜形成内突的现象普遍存在(图版Ⅲ-C)。

与11月份叶肉细胞相比，这时叶肉细胞的Ca²⁺主要分布在液泡(图版Ⅲ-A)和细胞质中(图版Ⅲ-B)；叶肉细胞间隙中Ca²⁺的分布较少，而且Ca²⁺沉淀颗粒分布比较分散，颗粒较小；细胞壁上的沉淀颗粒也减少，质膜内侧的Ca²⁺颗粒排列形成整齐的一圈(图版Ⅲ-B)，同时细胞质基质中的Ca²⁺沉淀也明显增加，并且沉淀颗粒较大(图版Ⅲ-E)；在叶绿体基质和细胞核的外侧也观察到Ca²⁺的分布，沉淀颗粒也较大(图版Ⅲ-D)。

2.4 翌年1月份叶肉细胞Ca²⁺的分布

北京在1月份已经进入严冬，平均气温是-5.6 ℃，这时叶肉细胞的细胞壁与质膜之间出现空隙，即出现质壁分离现象(图版Ⅳ-D)，质膜也出现内陷(图版Ⅳ-C)；细胞质变得稀疏，但细胞核结构完整，核仁清晰(图版Ⅳ-F)。虽然叶绿体的双层外膜还比较清晰，但已出现明显的膨胀变形，甚至有些叶绿体变成圆形，类囊体片层也大量减少，基粒类囊体和基质类囊体排列不规则，内有大量的嗜锇颗粒；另外还出现叶绿体的异常膜泡化现象(图版Ⅳ-B)。细胞中的线粒体有明显的增加，线粒体的膜结构完整，有些线粒体开始轻微变形，膨胀变圆(图版Ⅳ-C)。细胞内有大小不等的液泡，液泡膜形成很多内突(图版Ⅳ-C)，有的质膜内陷与液泡膜相连(图版Ⅳ-E)。

在1月份，叶肉细胞的Ca²⁺主要分布在细胞质中。与前2个月生长的叶肉细胞相比，这时在叶肉细胞间隙中只有很少的Ca²⁺，细胞壁上的Ca²⁺沉淀颗粒也明显减少；而细胞质基质中的Ca²⁺沉淀却明显增加；在液泡中也可见少量的Ca²⁺沉淀，并且这些沉淀集中分布在靠近液泡膜的附近(图版Ⅳ-A)。另外，有些细胞的细胞器出现解体成为泡状结构，其所在的细胞的细胞质基质中分布着大量的Ca²⁺(图版Ⅳ-B)。这种异常的细胞结构和大量Ca²⁺在细胞质的积累，可能是由于长时间的低温胁迫使得叶肉细胞的膜系统遭受伤害，Ca²⁺不能达到稳态平衡而导致的。

为了验证上述观察的Ca²⁺颗粒分布的真实性，笔者做了对照试验。经过EGTA处理的超薄切片，在原来Ca²⁺分布的细胞间隙，液泡等部位变成与原来沉淀物形状相似的电子透明区域(图版Ⅳ-G，H)。这说明Ca²⁺沉淀颗粒被消除；上述切片中的Ca²⁺定位反应是真实的。

3 讨论

Ca²⁺作为信使实现信号转递的过程是通过精确控制细胞质Ca²⁺的时间、空间和浓度参数的变化来实现的(Jörg et al., 2010)；细胞质Ca²⁺精确的时空控制在细胞和整个植物对环境胁迫的响应中起着重要作用(McAish et al., 2009；Dodd et al., 2010)。低温胁迫过程中植物细胞内Ca²⁺浓度和分布的变化，是判断植物响应低温胁迫与信使介导关系的关键。近年来，关于低温胁迫引起胞内Ca²⁺浓度变化已有一些报道(陈由强等，2000；丁印龙等，2002；谢潮添等，2003)。本试验发现6月份北海道黄杨叶肉细胞的细胞基质中只有很少的Ca²⁺沉淀颗粒，而在液泡和细胞间隙中则存在较多的Ca²⁺沉淀颗粒。在11月末室外已明显降温时，虽然在叶肉细胞间隙和液泡仍有大量的Ca²⁺沉淀颗粒，但液泡中的很多沉淀颗粒趋向液泡膜的内侧，而且细胞质基质中的Ca²⁺沉淀颗粒也明显增加。这表明随着室外气温的降低，液泡和细胞间隙中的Ca²⁺通过膜上的Ca²⁺转运通道或其他途径进入到细胞质基质中。这与前人在研究低温胁迫对董棕(Carvota urensl)(谢潮添等，2003)、耐冷性番茄(Cyphomendra betacea)(雷江丽等，2000)和枇杷(Eriobotrya japonica)(陈由强等，2000)中观察到的细胞中Ca²⁺浓度的变化是一致的。Ca²⁺的这种时空变化可能启动和调节了相应的抗寒基因的转录与调控，从而引发一系列与增强抗寒性相关的生理生化反应，如耐冷相关蛋白的出现，保护酶(如过氧化物酶，过氧化氢酶，ATP酶等)活性增强，内源保护物质增加等，从而提高植物的抗寒力(Monroy et al., 1995；雷江丽等，2000)。而笔者也观察到在11月份叶肉细胞的细胞器结构基本保持正常，这说明北海道黄杨在这个时期通过自身的调节抵抗了低温的伤害。至12月份，北海道黄杨处于抗寒锻炼的过程中，这时在叶肉细胞间隙只有很少的Ca²⁺沉淀颗粒；而细胞质基质的Ca²⁺沉淀颗粒却显著增加；但在液泡中仍然有较多的Ca²⁺沉淀颗粒且分布在液泡的中央，这可能是由于叶肉细胞长时间受低温胁迫，液泡膜轻微破损，使得部分已经进入细胞基质中的Ca²⁺通过液泡膜的破损部分又重新返回液泡中。在12月份，叶肉细胞的叶绿体发生膨胀，大液泡转变成小液泡，其他细胞结构基本没有异常变化，这说明在12月份时叶肉细胞Ca²⁺也基本处于稳态平衡，没有对细胞结构造成太大的伤害。到了最冷的翌年1月份，叶肉细胞的细胞间隙和液泡只有很少的Ca²⁺沉淀颗粒，而在细胞质基质中出现较多的Ca²⁺沉淀颗粒；而且这一时期一些叶肉细胞的细胞器发生解体变为泡状结构，并且这些发生细胞器解体的细胞质基质中分布着较多的Ca²⁺沉淀颗粒。北海道黄杨叶肉细胞在室外露天降温过程中发生的细胞超微结构和Ca²⁺的动态变化与前人对夏威夷椰子(Pritchardia gaudichaudir)幼苗低温胁迫96 h过程中叶肉细胞发生的变化相似。其原因可能是由于长时间的低温胁迫，导致原来储存在细胞间隙和液泡中的Ca²⁺进入细胞质基质中，引起细胞质Ca²⁺浓度升高，扰乱了细胞的正常生理代谢平衡，改变了质膜的通透性和造成细胞骨架的破坏，从而使植物细胞表现出各种细胞结构紊乱的寒害特征。

北海道黄杨在露天越冬的过程中，伴随着叶肉细胞Ca²⁺的动态变化，叶肉细胞中的叶绿体由最初的梭形或椭圆形逐渐膨胀变圆；在叶绿体中产生大量的嗜锇颗粒；淀粉粒消失。淀粉粒可能降解生成可溶性糖以提高细胞中溶质的浓度及渗透压，防止细胞结冰。另外叶肉细胞中线粒体数量增多，可能是细胞响应低温胁迫，满足合成某些抵御低温胁迫所需的物质特别是一些保护酶的需要；液泡由大液泡转变成多个小液泡，增加了液泡膜的表面积有利于细胞内的水迅速流到细胞外结冰，避免胞内结冰伤害细胞膜。叶肉细胞这些适应性变化使北海道黄杨表现出较强的抗寒性。

虽然笔者观察到北海道黄杨露天越冬过程中叶肉细胞内Ca²⁺的浓度和分布变化与植物细胞结构在低温胁迫下受到的伤害程度存在一定的相关性，但是低温如何引起细胞Ca²⁺浓度和分布的变化以及这种变化如何调控细胞发生适应性变化仍需要进一步深入的研究。