林业科学  2011, Vol. 47 Issue (12): 154-157   PDF    
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牛小云, 黄大庄, 杨敏生, 李晓芬, 付新爽
Niu Xiaoyun, Huang Dazhuang, Yang Minsheng, Li Xiaofen, Fu Xinshuang
Btcry3A抗虫基因杨树中毒蛋白的时空表达
Temporal and Spatial Expression of Bt Toxic Protein in Transgenic Btcry3A Hybrid Poplar 741
林业科学, 2011, 47(12): 154-157.
Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(12): 154-157.

文章历史

收稿日期:2010-03-21
修回日期:2010-04-11

作者相关文章

牛小云
黄大庄
杨敏生
李晓芬
付新爽

Btcry3A抗虫基因杨树中毒蛋白的时空表达
牛小云1, 黄大庄1, 杨敏生1, 李晓芬2, 付新爽2    
1. 河北农业大学林学院 林木种质资源与森林保护重点实验室 保定 071000;
2. 天津市宁河县苗圃场 天津 301507
关键词:转基因杨树    抗虫基因    毒蛋白    时空表达    
Temporal and Spatial Expression of Bt Toxic Protein in Transgenic Btcry3A Hybrid Poplar 741
Niu Xiaoyun1, Huang Dazhuang1 , Yang Minsheng1, Li Xiaofen2, Fu Xinshuang2    
1. Key Laboratory of Germplasm Resources of Forest Trees and Forest Protection College of Forest, Agricultural University of Hebei Baoding 071000;
2. The Nursery Compound of Ninghe, Tianjin Tianjin 301507
Abstract: We further studied strain PCC1 of transgenic Btcry3A poplar 741, which had stable resistance to the pest, and examined the Bt toxic and soluble proteins of twig xylem, leaf and root at different developmental time. The results showed that there was no difference in soluble protein content between transgenic and CK strain, but the soluble proteins of the root and the twig xylem and leaves of different parts in the crown presented a certain regularity. The proteins in twig xylem and roots increased all the time while the proteins in the leaf first decreased and then increased in the whole growing seasons. The expression of Bt toxic protein in xylem increased from upper to lower crown and the expression in leaves decreased from upper to lower crown; the expression of Bt toxic protein in xylem first increased and then decreased with the peak in September. However the expression in leaves and roots did not exhibit a certain regularity with the time on.
Key words: transgenic poplar    insect-resistance gene    Bt toxic protein    temporal and spatial expression    

Btcry3A基因741杨(Populus×aldatomentosa cl. 741)目前已进入中间试验林阶段,近几年来一些学者对转Btcry3A基因741杨不同株系的抗虫性进行了一系列的室内和野外测定,研究了转Bt基因741杨对目标害虫产卵、生长发育及致死率的影响(甄志先等,2007; 王彦平等,2008; 王永芳等,2002)。测定结果表明转基因741杨不同株系对目标害虫表现出一定抗性。笔者的前期研究结果表明PCC1株系(原CC84株系)对桑天牛(Apriona germari)表现出了较强的抗性(牛小云等,2011),因此对此株系作进一步研究。

据报道CaMV35S启动子控制下的基因在不同植物或同一植物不同发育阶段的器官中表达强度有较大的差异(Pauk et al., 1995; Narváez-Vásquez et al., 1992; Williamson et al., 1989; Mazier et al., 1997),并且对转基因棉花(Gossypium)、玉米(Zea mays)等不同器官毒蛋白表达量的测定结果也得到了同样的结论(张俊等,2002; 陈旭升等,2006; 朱路青等,2005; 陈松等,2000; 姜志磊等,2008)。对启动子CoYMVP控制下的转基因杨树是否也存在同样的现象,目前还未见报道。本研究将对转基因741杨PCC1株系毒蛋白的时空动态表达量进行检测,为PCC1株系的推广利用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

中间试验林位于天津市宁河县宁河苗圃场(117.83°E,39.33°N),盐碱性土壤,年降水量642 mm,年无霜期240天,冬季最大冻结深度54 cm,年平均气温11.1 ℃; 面积约0.3 hm2,种植有2年生未转基因741杨(以下简称CK杨)、转Btcry3A基因抗虫杨树PCC1株系。试验林采用随机区组设计,25株小区,3次重复,2个处理,株行距2 m×4 m。于2010年的7月18号、8月9号、9月6号、10月16号,分别在CK杨以及PCC1株系的每个小区内随机选取1株树,共计3株,对树冠上部1年生枝条,中部、下部的2年生枝条,树冠上部、中部、下部发育完整但未老化的长枝叶及根进行取样。将采集的样本经液氮速冻处理后,放入保温冰盒中,带回实验室,保存于-80 ℃超低温冰箱中待测定。

1.2 可溶性蛋白的测定

植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种代谢的酶类,测定其含量是了解植物总代谢的一个重要指标,分别对PCC1株系及CK杨不同部位枝条木质部和叶片及根部的可溶性蛋白,在整个生长季节的时间表达动态,及树冠不同部位木质部和叶片可溶性蛋白在同一生长时期的表达量进行测定,比较转入外源基因对可溶性蛋白的表达有无影响,以及可溶性蛋白的表达规律。用考马斯亮蓝法测定(汪家政等,2001)。

牛血清蛋白制作标准曲线,用紫外分光光度计测定。以吸光值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线,根据标准曲线得到的标准方程为:y=0.000 7x-0.046 5,其中R2=0.990 4。利用标准曲线计算可溶性蛋白含量的绝对值。

1.3 毒蛋白测定

采用ELISA方法(甄志先等,2007)测定毒蛋白的表达量,ELISA试剂盒购自美国Agdia公司。木质部测定:将枝条韧皮部去掉,取木质部0.5 g,迅速放入研钵中,加入一定质量石英砂以及磷酸盐吐温缓冲液(PBST)进行研磨,加入的PBST总体积为5 mL; 再将研磨液12 000 r·min-1离心30 min,抽取上清液,将上清液再稀释80倍后,用于毒蛋白的测定。叶部测定:去除叶脉,称取0.5 g。根部测定:去除杂物,称取0.5 g。按试剂盒说明书进行测定,脱脂奶粉配制正对照(标样),1×PBST缓冲液做负对照。主要测定步骤:100 μL样品、正、负对照分别加入相应孔中—室温孵育1 h—FAX2600型洗板机1×PBST洗板7次—加入连接酶每孔100 μL—室温孵育1 h—FAX2600型洗板机1×PBST洗板8次—加入PNP溶液每孔100 μL—避光孵育1 h—用BioRad550型酶标仪在405 nm处读数。

以标样读数值为纵坐标,标样浓度为横坐标绘制标准曲线,根据标准曲线得到的标准方程为:y=26.301x-1.780 5,其中R2=0.991 8。利用标准曲线计算毒蛋白表达量的绝对值。

2 结果与分析 2.1 可溶性蛋白的时空表达

对PCC1号株系以及CK杨可溶性蛋白测定结果(图 1)进行比较,可以看出:PCC1号株系与CK杨在植株各器官以及各部位可溶性蛋白的表达量都没有差异,而且各器官可溶性蛋白的表达规律大致相同。木质部和根部可溶性蛋白呈现一直递增的趋势,叶片可溶性蛋白呈现的规律是先降低后升高再降低。叶部可溶性蛋白的表达量远高于枝条木质部和根部可溶性蛋白的表达量,这可能与各器官在树木生长过程中所发挥的功能不同有关。

图 1 CK杨和PCC1株系可溶性蛋白的时空表达 Figure 1 The temporal and spatial expression of soluble protein in PCC1 and CK poplar
2.2 毒蛋白的时空表达

对PCC1号株系及CK杨不同部位不同取样时期毒蛋白表达量进行测定,PCC1株系各部位均检测到毒蛋白,而CK杨各部位均未检测到毒蛋白。

1) 长枝叶毒蛋白的时空表达  从不同部位不同月份长枝叶毒蛋白的表达量测定结果(图 2a)可以看出:随林木生长时间延长,叶部毒蛋白的表达量除中部叶片呈下降趋势外,上部及下部叶片的毒蛋白表达量均在9月份达到了最高峰。叶部毒蛋白表达量在整个生长季节随时间变化的规律性不太强。在空间序列上,7,10月份叶片毒蛋白的表达量呈现明显的由上部到下部逐渐降低的趋势; 8月份中部叶片表达量稍高于上部叶片,下部叶片表达量最低; 9月份上部叶片表达量最高,其次为下部叶片,中部叶片表达量最低。在整个生长季节叶部毒蛋白的表达量总体呈现为从树冠上部到下部逐渐降低的趋势。

图 2 不同部位叶片和枝条木质部毒蛋白的时空表达 Figure 2 The toxic protein content of different part leaves and xylems on the temporal and spatial

2) 枝条木质部毒蛋白的时空表达  从不同部位不同月份枝条木质部毒蛋白的表达量测定结果(图 2b)可以看出:在时间上,树冠各部位木质部毒蛋白表达量的规律基本相同,都是在8,9月份达到最高,10月份开始急剧降低。在空间上木质部毒蛋白的表达呈现出较强的规律性,7—10月份木质部毒蛋白的表达量都呈现出从树冠上部到下部逐渐升高的趋势。

3) 不同发育时期根部毒蛋白的表达量  从不同发育时期根部毒蛋白表达量测定结果(图 3)可以看出:根部毒蛋白的表达量呈现先降低后升高再降低的趋势。这可能与根部的生理代谢有关,由于根部毒蛋白的表达量较叶部和木质部都偏低,因此通过根际分泌物传递到土壤中的毒蛋白对土壤微生物造成危害的机率会更小。

图 3 不同发育时期根部毒蛋白表达量 Figure 3 The toxic protein content of root segment at different development time
3 结论与讨论

对CK杨及PCC1株系可溶性蛋白测定结果表明,外源基因的转入对可溶性蛋白的表达没有影响,并且可溶性蛋白在时间序列上的表达量呈现出一定的规律。木质部和根部总蛋白呈现一直递增的趋势,分析原因可能为8,9月份是林木生长的高峰期所以可溶性蛋白表达量高; 而10月份气温降低,树木进入落叶期后可溶性蛋白表达量仍呈上升趋势,一方面原因可能是与可溶性蛋白的功能有关,此时抗冻蛋白分泌会升高,已有研究表明可溶性蛋白与植物抗寒性呈正相关(梁博文,1994),另一方面可能与林木的内循环有关,已有研究证明有机物质在叶片衰老过程中会发生迁移(徐福余等,1997),所以可能是叶片中的可溶性蛋白转移到了枝条内部。叶片可溶性蛋白呈现的规律是先降低后升高再降低,这个规律与宁晓光等(2009)对银中杨(Poplus alba ‘Berolinensis’)叶片可溶性蛋白季节变化规律的研究结果相同,是否巧合,还是有一定的生理机制,其原因有待于进一步研究。

对PCC1株系毒蛋白的时空动态表达的研究结果表明,在时间上木质部呈现了8,9月份表达量最高,10月份急剧下降的趋势; 叶部在时间上规律不太明显; 根部在时间上规律也不太明显,但在9月份表达量达到了最高,这与枝条木质部毒蛋白表达量达到高峰的时期相同。在空间序列上叶部和根部毒蛋白表达量都呈现较强的规律性。叶部毒蛋白表达表现为从树冠上部到下部依次递减的趋势,这与甄志先等(2007)对PCC1株系5月份及9月份不同部位叶片毒蛋白表达量的测定结果一致。分析原因可能与冠层效应有关,研究表明由于树冠结构和几何特征对太阳辐射和降水的影响,使能量传输和分配呈现冠层的空间异质性,导致光合作用在冠层空间上的不同(Anten,2005; 富丰珍等,2010)。叶片有机物质的积累主要是通过光合作用,光合作用的强弱对毒蛋白的表达起到至关重要的作用,树冠上部叶片光合强度大所以毒蛋白的表达量相应偏高。另外,由于所取叶片发育程度大致相同故排除叶龄影响。已有大量研究表明转基因棉花不同叶龄期毒蛋白的表达量不同(陈松等,2000; 孙伟等,2005),但转基因741杨不同叶龄期毒蛋白表达量是否也存在这一规律,有待于进一步研究。

枝条木质部毒蛋白的表达量呈现由树冠上部到下部依次递增的趋势,分析原因可能是因所取枝条发育程度不同,上部枝条为1年生,中下部枝条为2年生,枝条总体发育程度由上到下为递增趋势; 枝条发育程度不同导致木质部的生长量不同,根据林木生长模型,在林木成熟前,木材生长量是连年递增的,所以枝条木质部的增长量也应该存在这个规律; 由树冠上部到下部木材生长量越来越大,相应枝条内部的代谢强度越来越大,所以毒蛋白的表达量呈现由树冠上部枝条到下部枝条越来越大的趋势。2年生木质部毒蛋白表达量大于1年生木质部毒蛋白表达量,毒蛋白在木质部是否存在连年累积现象需要进一步研究。

按器官划分毒蛋白的表达量,也呈现一定规律,木质部>叶部>根部。根本原因是毒蛋白在各器官的表达强度不同。许多学者对转基因棉花(孙伟等,2005)、转基因大豆(Glycine max)(朱路青等,2005)及转基因玉米(王建武等,2003; 李葱葱等,2006; 姜志磊等,2008)各器官毒蛋白的表达量进行研究,也得到了同样的结论。木质部是桑天牛幼虫危害的部位,毒蛋白表达量大有利于杀死桑天牛幼虫。

另外各器官各部位毒蛋白的表达量都与其生理活性密切相关,各项生理指标旺盛时期,毒蛋白的表达量相应偏高。可见转基因林木虽然在某方面大大提高了林木对害虫的抗性,但抗性程度的高低与树势关系密切,所以对林木的合理栽培管理对转基因林木的抗虫性有很大的促进作用。

对各器官的毒蛋白表达规律测定中发现,木质部毒蛋白表达量最高,根部毒蛋白表达量在所有部位中最低。木质部毒蛋白表达量10月份开始下降,保证了木材收获后使用的安全性; 叶片毒蛋白在10月份进入落叶时期毒蛋白表达量也偏低,则叶片降解后,使毒蛋白通过根际分泌物进入土壤的机率降低。当然,这都需要试验进一步验证。

综上所述,PCC1株系毒蛋白的表达在不同发育时期和不同组织部位都呈现了一定的规律。启动子CoYMVP控制下的基因在同一植株不同发育阶段的器官中的表达强度也存在一定的差异。

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