21世纪是环保的世纪，化学农药带来的环境和健康的危害引起了人们广泛关注(Antonious et al., 2003)。因此，寻求一种安全有效、不破坏生态环境的新型农药成为研究热点之一。研究者为了寻找传统农药的替代物，对芳香植物做了大量的研究(Irfan et al., 2004)，发现芳香植物提取成分对农业害虫能产生有效的毒杀、趋避、拒食作用(章晴等, 2010; Mansour et al., 1986; Shaaya et al., 1991; Ho et al., 1997; Landolt et al., 1999)。芳香植物以其资源丰富、不破坏生态环境、选择性强、不杀伤害虫天敌等优点越来越受到人们的重视(李秀梅等, 2010; Wang et al., 2009; Ardeshir et al., 2002)。

薄荷(Mentha piperita)，属唇形科，作为一种常见的芳香植物被广泛种植。其性凉味辛，具有宣散风热、清头目、透疹之功效, 用于治疗风热感冒、风温初起、头痛、目赤、喉痹、口疮、风疹、麻疹、胸胁胀闷等(国家药典委员会, 2000)。现代研究发现：薄荷含挥发油、黄酮、有机酸、氨基酸等化学成分，对中枢神经、消化、呼吸、生殖等系统的药理作用明显(梁呈元等, 2003)。薄荷油中主要成分为L-薄荷脑(薄荷醇)，含量为77%~87%，其次是L-薄荷酮，含量为8%~12%，还有少量薄荷酯类(陈光亮等, 2000)。薄荷不仅对真菌、病毒有一定的抑制与杀灭作用(Edris et al., 2003; Schuhmacher et al., 2003)，而且对豆象(Callosobruchus spp.)也有很强的熏杀作用(Ahmed et al., 1986; Raja et al., 2001)。然而，目前对薄荷的毒杀机制还未作深入探讨。笔者研究发现薄荷石油醚提取物对朱砂叶螨(Tetranychus cinnarinus)亦有很强的毒杀活性，而前人对此鲜有报道。朱砂叶螨作为林业有害生物之一，在柑橘(Citrus reticulata)、梨(Pyrus spp.)、苹果(Malus pumila)、桃(Amygdalus spp.)、枣(Ziziphus spp.)等林果上危害尤为严重。为探索薄荷对螨类的毒杀机制，对其活性成分进行了分离，并主要研究其活性成分对朱砂叶螨体内几种酶的影响，旨在为新型植物性杀螨剂的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

薄荷采自北京农学院芳香植物种植基地。取其地上部分清洗干净后放于通风处阴干(25℃±3℃)，用粉碎机(北京环亚天元Pulverizer-6202)进行粉碎，粒度60目，4 ℃冰箱(Electrolux BCD-281EA)内储藏。

供试螨为朱砂叶螨成螨，为实验室内豇豆(Vigna unguiculata)幼苗饲养的敏感品系。饲养环境为(25±1)℃，RH 60%±5%，光照L:D=18 h:6 h(Rudd, 1997)。取饲养一致、活动力强的成虫供试。

此外，试验所用其他试剂及仪器如下：TU-1800紫外可见光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，高速冷冻离心机(HITACHI RX)，电子天平(北京赛多科恩仪器有限公司)，OLYMPUS SZ51双目立体显微镜(日本奥林巴斯有限公司)，Leica EM FC6超薄切片机(德国Leica仪器有限公司)，JEM-100CXⅡ型透射电子显微镜(日本岛津公司)，1 000 μL移液器(德国Eppendorf股份公司)。

1.2 薄荷活性成分的分离

将植物干粉加入6倍体积的石油醚，室温下(25±3)℃浸提3次，每次3天，过滤，合并3次的提取液减压浓缩，得石油醚粗提物; 称其8 g作为大柱上样样品，选用200 ~300目柱层析硅胶(青岛海洋生物试剂厂生产)进行分离纯化(Buchi, C-615)。条件：120 ℃活化，柱内直径100 mm，填料高度400 mm。以石油醚、氯仿、甲醇(分析纯，北京化学试剂公司)进行梯度洗脱，在一种洗脱体系下无流分产生，改换洗脱体系配比。流速为10 mL·min^-1，分步收集，每瓶50 mL。薄层板(青岛海洋化工厂)检测，110 ℃活化。碘缸中显色，合并相同组分，共得8组流分。

1.3 毒力测定

毒力测定参照文献(Wang et al., 2007)测定螨抗药性的方法并改进。取适量上述流分浓缩药膏与乳化剂吐温-80(体积比10:1)充分搅拌混匀，加入适量蒸馏水配制成2 mg·mL^-1药液，以无药膏的吐温-80为对照，采用玻片浸渍法(FAO, 1980)进行生物活性测定。用双面胶将健康活泼、大小一致的30头雌成螨粘于载玻片的一端，药液中浸5 s后取出，用滤纸吸去螨体及周围多余药液，置于室温(25±1)℃下，24 h后观察其死亡情况，接触动者为活，不动为死。生测后得到1种有效流分。

1.4 症状观察 1.4.1 形态观察

取平展的豇豆叶片洗干净，叶面朝下放到培养皿(直径10 cm)上，每一叶片挑入成螨30头，待成螨稳定后，夹取叶片浸入药液5 s，以与药液等浓度的乳化剂蒸馏水溶液为对照，将叶面朝下放到培养皿上，叶片边缘用湿脱脂棉围住，防止螨逃逸。从2~24 h每隔2 h观察1次成螨的状况，记录其活动情况及反应。

1.4.2 透射电镜材料制备

在24 h后，随机取上述形态观察的处理及对照样品各3头，用3%戊二醛前固定过夜，0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH=7.2)中冲洗3 h。1%锇酸4 ℃下固定1 h，0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液冲洗0.5 h。30%~100%不同含量酒精逐级脱水，每级脱水10 min。环氧树脂浸透、包埋、聚合。超薄切片机切片，醋酸铀、柠檬酸铅双染色，透射电镜观察成螨中毒后颈部体壁细胞亚显微结构，并拍照。

1.5 酶活性测定 1.5.1 酶液制备

以2mg·mL^-1药液触杀处理朱砂叶螨雌成螨，处理后不同时间(4, 8, 12, 16, 20, 24 h)取样，每次取样的朱砂叶螨雌成螨均为150头。根据测定目标酶的不同，放入不同的溶液中，冰浴匀浆后，10 000 r·min^-1、4 ℃下离心15 min，取上清液备用(曹挥等，2003)。其中单胺氧化酶(MAO)和蛋白酶放入0.25 mL生理盐水中, 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)置于60 mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH=7.0)中, 乙酰胆碱酯酶置于0.1 mol·L^-1磷酸缓冲液(pH=7.5)中。

1.5.2 活性测定

GSTs活性测定参照慕立义(1994)的方法，将66 mmol·L^-1磷酸缓冲液2.5 mL、50 mmol·L^-1GSH 0.2 mL、0.03 mol·L^-1 CDNB 0.05 mL迅速混匀作为对比，将以上试剂再加0.1 mL制备好的酶液作为试样，反应条件为27 ℃，在340 nm波长下，测定光吸收值，重复3次。

乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定：以ACh为底物，对称三硝基苯(TNB)为显色剂，毒扁豆碱为抑制剂。反应条件为27 ℃，保温15 min，用1 mmol·L^-1的毒扁豆碱0.3 mL终止反应，在412 nm波长下测定光吸收值，重复3次。

MAO活性测定：以MAO的特异性底物苄胺为反应底物，测定其反应产物苄醛的生成量。利用苄醛在紫外部分λ＝242 nm处的吸收高峰，测定酶作用反应后的光吸收值，测定MAO的酶活性，重复3次。

蛋白酶活性测定：取制备好的0.05 mL酶液，在37 ℃水浴中预热3~5 min，加入1 mL预热到37 ℃的酪蛋白溶液，混匀后置于37 ℃水浴中加热15 min，加入3 mL 10%三氯乙酸，混匀后离心。取上清液1 mL，加5 mL 0.5 mol·L^-1碳酸钠，1 mL Follin-酚试剂，在37 ℃水浴中显色15 min。用分光光度计于680 nm波长处测光吸收值，重复3次。

1.6 统计分析

按Abbott(1925)公式对成螨死亡率进行校正。将校正死亡率所得数据用Finney机率分析法求出毒力回归方程，并对该方程式进行卡方适合性检验。当回归式符合实际情况后，求出LC₅₀以及LC₅₀的95%置信限; 对酶活测定所得数据结果进行方差分析。所有数据均以Excel和DPS(V3.01)软件处理。

2 结果与分析 2.1 柱分离结果

从表 1中看到：在最终分离出的8种组分中，组分Ⅴ的杀螨活性最高，24 h的LC₅₀值为0.546 4 mg·mL^-1，其95%置信区间为0.326 8~0.913 4 mg·mL^-1；组分Ⅰ次之，24 h内的LC₅₀值为0.871 8 mg·mL^-1，95%置信区间为0.472 7~1.607 7 mg·mL^-1。组分Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅵ的LC₅₀值分别为1.268 1，1.745 3，1.889 9，1.814 9 mg·mL^-1。由表 1看出，在分离出的8个组份中，组份Ⅷ的杀螨效果最差，其LC₅₀为12.505 mg·mL^-1，置信区间为8.439 3~18.529 3 mg·mL^-1。可见薄荷杀螨活性物质主要存在于第5洗脱体系中。在石油醚洗脱体系段的流分Ⅰ也显示出较好效果，初步推断薄荷中存在2种杀螨活性成分，或者流分Ⅰ在触杀过程中起协同作用。组分Ⅴ的活性相对于石油醚粗提物而言有明显提高，对朱砂叶螨具有较好的触杀活性。

2.2 对朱砂叶螨体内MAO活性的影响

从图 1可以看出：用流分Ⅴ处理雌成螨后，对照组与处理组MAO活性在4~12 h先升高后降低，8 h时达到高峰，处理组MAO活性是对照组的1.9倍。在12~20 h处理组的MAO活性降低，对照组先升高后降低。在16 h和20 h时，对照组和处理组酶活性差异不大。从20~24h，处理组与对照组酶活性都升高，处理组升高更快。24h内，处理组与对照组MAO活性变化规律基本相同，但是整个变化过程中处理组酶活性都大于对照组，处于被激活状态。

2.3 对朱砂叶螨体内GSTs活性的影响

GSTs是许多生物体内重要的解毒酶系之一，是生物体内的一类与抗性有关的初级代谢及次级代谢酶系。由图 2可以看出：用流分Ⅴ处理朱砂叶螨雌成螨后，其体内GSTs活性有先上升后下降的趋势，对照组酶活性在4~12 h之间先下降后升高，12 h后持续下降。整个过程中处理组的活性均高于对照组，尤其在处理后8 h和24 h时，对照组活性与处理组的活性差异显著(P＜0.05)。可见，流分Ⅴ对朱砂叶螨雌成螨体内GSTs有一定的激活作用。

2.4 对朱砂叶螨体内AchE活性的影响

流分Ⅴ处理朱砂叶螨雌成螨后，结果如图 3所示：4~24h，处理组螨体内的AchE活性与对照组相比，变化趋势大致相同，但处理组均低于对照组，AchE被抑制。在12h时，处理组酶活性降到最低点。在4~12h，对照组和处理组酶活力都有下降的趋势，与对照组相比，处理组酶活被强烈抑制。但12~16h之间，处理组酶活力开始明显上升，后来一直下降; 而对照组12~20h之间，一直上升，后又下降，在24h时降到最低点。可见，AchE可能是流分Ⅴ在朱砂叶螨体内的重要靶标之一。

2.5 对朱砂叶螨体内蛋白酶活性的影响

蛋白酶是生物体内的主要消化酶系，蛋白质在蛋白酶的作用下，分解成为多肽或氨基酸，被肠壁细胞吸收。蛋白酶的升高或降低会直接影响生物体对蛋白质的代谢。从图 4可以看出:用流分Ⅴ处理雌成螨后，处理组蛋白酶比活力值比对照组低，除在4和24 h时，处理组活性明显大于对照组(P＜0.05)，其余时间处理组比对照组有所下降，但在12, 16, 20 h时差异不显著(P＜0.05)，在24 h时处理组的蛋白酶活力急剧上升。总的来看，蛋白酶活性在用流分Ⅴ处理后被抑制。

2.6 症状观察 2.6.1 药液处理后雌成螨的外观表现

为了初步推测药液对螨类的毒理作用，观察药液处理雌成螨后的症状表现，发现其对成螨的作用大致可划分为以下几个阶段(图 5)：

静止期(0~4h)：大部分成螨静止，其足部处于收缩状态，无明显反应，但少数螨爬行缓慢;

兴奋期(4~10h)：螨足不停地乱动，四处频繁爬动，表现活跃;

痉挛期(10~18h)：过度兴奋，身体不协调，运动失衡，足颤抖频繁，有排卵现象产生，螨表皮血丝明显增多，颜色变深;

死亡期(18~24h)：活动明显减少，腿部缓慢收缩伸张，头部逐渐收缩至死亡。有黑色颗粒状排泄物，螨表皮血丝颜色变暗红。

药液处理成螨后，先静止不动，经过短暂的兴奋后，螨体大量进入麻痹期，经过长达8 h的麻痹期后，进入死亡期，有黑色排泄物。初步推断药液可能通过影响螨的神经系统和消化系统，对螨产生胃毒、抑制生长发育、抑制繁殖等多种作用。

2.6.2 药液处理后雌成螨颈部体壁细胞亚显微结构

采用透射电镜观察对照组和处理组(24 h后)朱砂叶螨雌成螨的亚显微结构变化(图 6)。由图可见：处理组和对照组螨的亚显微结构差异非常明显。对照组螨的内质网结构完整，整齐且规律排列; 细胞核清晰可见，核膜完整，核仁亦可分辨; 线粒体丰富、规则，内嵴有规律排布，清晰可见。细胞内的内质网、线粒体、细胞核膜系统均未受破坏; 表皮结构致密，有规则的突起。处理组螨的表皮内部细胞亚显微结构破坏严重，膜结构不复存在。细胞器完全溶解，无法辨认。形成无数空腔和溶解、半溶解的残质; 表皮呈萎缩状，突起破坏严重，与对照比较，排列很不规则。

3 结论与讨论

通过对流分Ⅴ处理雌成螨后的症状观察，可以看出薄荷活性成分对朱砂叶螨可能存在不同作用方式，对神经系统和消化系统都有一定的影响。进一步的研究也证明处理后的螨体内多种酶都发生了变化，并引发了螨体内的一系列生理生化反应，最终导致其死亡。

GSTs是生物机体内重要的代谢酶系之一。该酶存在于生物机体的各种组织中，通过催化还原性谷胱甘肽(GSH)与具有亲电子基团的化合物进行轭合反应来降低细胞毒性，具有消除体内自由基和解毒的双重功能(瞿建宏等, 2006)。该酶在自然界普遍存在, 在脊椎动物、无脊椎动物和植物对异源物质的解毒代谢中起重要的作用。植物次生物质、杀虫剂、除草剂和其他异源物质都可作为该酶的底物。已有的研究证实GSTs在昆虫对杀虫剂的解毒中起着重要的作用(陈凤菊等, 2003; Ku et al., 1994; Prapanthadara et al., 2000)。本试验中流分Ⅴ处理试螨，激发了其体内GSTs的活性以进行解毒作用，药物处理后8 h内尤为明显，这说明该流分使螨处于中毒状态。神经系统是目前大多数农药的作用靶标，AchE和MAO是生物体内影响神经系统的2个主要的酶。AchE是一种丝氨酸水解酶, 它主要存在于中枢神经灰质、交感神经节等处，主要功能是在胆碱能神经突触处通过快速水解神经递质乙酰胆碱(ACh)而中止神经冲动的传递(王敦等, 2006)。本实验发现流分Ⅴ处理后该酶的活性受到强烈抑制，说明乙酰胆碱正常代谢受到阻碍，从而导致神经信号传递被破坏。MAO是参与生物源氨代谢的一个重要的酶类，催化5-羟色胺脱氢氧化，形成5-羟色醛，最后代谢成5-羟吲哚乙酸排出体外。而有些毒物可与5-羟色胺竞争，与MAO作用，从而干扰5-羟色胺的正常代谢(陈家长等, 2006)。MAO被抑制，会造成神经胺积累，而单胺的积累也是造成神经传递阻断的一个原因，有些神经突触传递处是以神经胺为传递物质的，如去甲肾上腺素、多巴胺、章鱼胺等(曹挥等, 2007)。这些物质的积累与乙酰胆碱在胆碱激性突触处的积累一样，必然会引起传导阻断。流分Ⅴ处理后的试螨体内MAO活性除在16 h和20 h活性与对照相似，其余时间其活性都强于对照组，说明以神经胺为传递物质的途径未被抑制。

从整个试验的过程来看，可以初步推断，在处理后4~10 h之间，AchE与蛋白酶活性受到了一定程度的抑制，而GSTs被激活，起到解毒作用，螨体神经系统及消化系统均处于失调状态初期，所以症状观察为过度活跃; 在10~18 h之间，AchE与蛋白酶继续处于被抑制状态，这使螨神经系统及消化系统深度受损; MAO和GSTs活性为激活状态，增加了对神经胺的去除，GSTs也在继续解毒，此时螨体进入痉挛期; 18~24 h，此时MAO和GSTs的活性被强烈激活，但AchE也被强烈抑制，中枢神经系统轴突传导逐渐被阻断，周缘神经正常突触传递受阻严重，对照组与处理组蛋白酶活性急剧升高，表明螨体此时已通过蛋白分解来维持能量供应。处理组比对照组升高更明显(P＜0.05)，电镜观察，此时组织蛋白开始分解，体内大量细胞的生理机能衰退，身体逐渐收缩，进入死亡期。

电镜结果显示进入死亡期的成螨表皮失去了原有的饱和度，出现萎缩状，规则突起破坏严重，可能更有利于药液的渗入，加剧死亡。试验结果显示:这个时期蛋白酶活性升高，对细胞器上有蛋白的结构进行了自溶，呈现溶解空洞，电镜下观察处理组细胞器无法辨认。

综合以上结果可以推测，AchE和蛋白酶长时间被抑制引起了神经突触传递阻断和蛋白代谢紊乱，可能是流分Ⅴ引起试螨死亡的主要原因