流苏(Chionanthus retusus)属木犀科(Oleaceae)流苏属(Chionanthus)，落叶灌木或小乔木。流苏适应性强, 寿命长，成年树高大优美，是优良的园林观赏树种。既可于草坪中数株丛植，也宜于路旁、林缘、水畔、建筑物周围散植，还可制作盆景。产于河北、山东、山西、河南、甘肃及陕西，南至云南、福建、广东、台湾等地。性喜光，也较耐荫；喜温暖气候，也颇耐寒；耐干旱瘠薄；耐风及抗空气污染力强(杨玉梅等，2005)。随着经济发展，人们对盐碱地的绿化和娱乐场所的开发越来越多，但土壤较高的含盐量限制了园林绿化植物的种植，成为盐碱地区开发的一个瓶颈(朱会娟等，2007；孟凡娟等，2008)。河北省盐碱地区任丘市引种流苏后花繁叶茂、长势良好；栽培地土壤pH 8.7，引种时未采取任何改碱排盐措施(邓运川，2006)，因此研究其抗盐性对指导园林绿化有着积极的作用。

电导法是传统的评价植物抗逆性的方法，其鉴定的原理是环境胁迫伤害细胞膜，改变膜透性，使胞质外渗量增加，电解质渗透率高，因而组织浸出液中电解质浓度增高，电导度升高(张钢，2005)。膜透性测定方法采用电导法，通过所测数据来反映流苏树种耐盐性。

测定植物组织和器官的电阻抗图谱(electrical impedance spectroscopy，EIS)是用等效电路来表示所测定的组织样本，当受到胁迫时，细胞内的这些变化就可以通过图谱参数记录下来。因此测定植物组织和器官的EIS已被广泛用于估测植物活力、养分状况、果实受害程度、抗寒性和对含盐量敏感度等方面(Repo et al., 2000；李亚青等，2008；董胜豪等，2009)。已有研究中，EIS法提供了非破坏性地测定胞内电阻、胞外电阻和膜变化的手段，因而可以考虑用EIS参数来反映流苏受盐胁迫的程度。

本试验以2年生流苏苗为材料，采用传统的电导法和新的估测植物抗逆性的电阻抗法测定在不同时间、不同浓度NaCl胁迫条件下叶片和茎EIS参数和膜透性的变化，研究EIS参数与电导率的变化规律及相关关系，试通过建立EIS参数与生理指标之间的相互联系，结合通径分析，为证明EIS法是研究观赏植物受盐胁迫程度的一种有效方法提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验于2010年5—7月进行，供试材料2年生流苏树苗，取自河北省定州市苗圃基地(38°46′ N，115°46′ E)。2010年5月5日移栽120株至河北农业大学标本园温室内(河北省保定市，38°50′ N，115°26′ E)。苗木栽植于上直径26 cm、下直径18.5 cm、高20 cm的塑料盆中，每盆1株，培养基质为沙土(土和沙的比例为2 :1)。

1.2 试验方法

试验设置3种不同浓度的NaC1溶液(0.4%，0.8%，1.2%)处理，以清水为对照(CK)。每处理3个重复，共12个试验小区，每盆流苏苗随机放入各试验小区中，每个试验小区10株。试验开始时经控水各盆中土壤含水量大致相等，于2010年6月13日开始处理，每5天用不同浓度的NaCl溶液浇灌苗木，每次每盆1升。处理时盆下放托盘，当溶液流出时，再用托盘将渗出来的溶液倒回盆中，以防止盐分流失；灌前用自来水充分淋洗基质，以保持盐度不变(甘海峰等，2010；杨成龙等，2010)。在处理后的第5，10，15，20天，采样分析叶和茎的电导率和电阻抗指标变化。

1.3 测定方法 1.3.1 电导率(EL)的测定

将叶片用去离子水冲洗干净，使用直径5 mm的打孔器在叶片样品上打孔，每试管中放置8片圆叶片，分别加入12 mL去离子水，每个样品4次重复；将茎用去离子水冲洗干净，切取长1 cm的一段茎，中间劈成4瓣放入试管，加入12 mL去离子水，每个样品4次重复。使用Parafilm膜封口后，放入摇床中振荡24 h，之后用DDSL-308型电导仪测定初电导值(E₁)和空白电导值(E_B1)；封口后将试管置于水浴锅沸水浴30 min，组织死亡和电解质释放稳定后再放到摇床上振荡24 h，测定终电导值(E₂)和空白电导值(E_B2)。用公式(1) 计算相对电导率(白宝璋等，1995)：

(1)

1.3.2 电阻抗(EIS)参数的测定

用电阻抗法(Repo et al., 2004)测定EIS参数，测定样本在42个频率(80 Hz~1 MHz)下的电阻值和电抗值。以上述频率下测定的样本电阻和电抗值分别作为实部和虚部，做出电阻和电抗随频率的变化曲线，即EIS。根据样本的电阻抗图谱确定适用的等效电路。流苏叶和茎的图谱为单弧，用单－DCE模型(属于分布模型)(Zhang et al., 2002)。等效电路参数用LEVM8.06(Macdonald JR)软件进行拟合(Repo et al., 1994)。每处理设8次重复。该模型中阻抗的表达式为：

(2)

式中：Z为阻抗；R为高频电阻，R₁为低频电阻[ R和R₁分别根据高频弧和低频弧与x轴(实部，即电阻值)的交点获得](Zhang et al., 2003)；i = ，是复数算符；ω为角频率；ω = 2×π×f，其中f为频率；τ为弛豫时间；ψ为弛豫时间的分布系数。

胞外电阻R_e(extracellular resistance)用下式求得：

(3)

胞内电阻R_i(intracellular resistance)用下式求得：

(4)

根据每一个样品的截面积和长度归一化，计算各电阻率参数：

(5)

式中：r_x是电阻率(x表示胞外e或胞内i)，r和r₁分别为根据样本的截面积和长度归一化后的高频电阻率和低频电阻率，单位为Ω ·m；R_x是测定的电阻，单位为Ω；A是样本横切面面积，单位为m²；l是样本长度，单位为m(Repo et al., 2000)。

弛豫时间和弛豫时间的分布系数不作归一化处理。

1.4 统计分析

用Independent-samples T test(SPSS17. 0) 分析流苏的叶片和茎EIS参数和电导率的差异显著性。EIS法，用LEVM8.06软件拟合出EIS参数值，将数据导入Microsoft excel作图。EL法，用Microsoft excel计算E值，作图。用SPSS17. 0对流苏叶片和茎的EIS参数与相对电导率进行均值和均值标准误的分析。

用SPSS17. 0对流苏叶片和茎的EIS参数与EL法求出的电导率进行回归分析和求相关性并进行通径分析，给出决定系数R²评价回归方程的可靠性和准确性，给出线性相关系数r评价相关性，以及给出通径系数。

2 结果与分析 2.1 NaCl胁迫对流苏膜透性的影响

随着胁迫时间的延长，流苏叶的电导率除了对照在处理第20天有下降外，其他各处理整体显上升趋势(图 1A)；每一个处理第5~10天都有1个明显增加的趋势，1.2%NaCl处理在处理第15天时电导率显著高于第5天(P < 0.05)，处理第20天也极显著高于第5天(P <0.001)(图 1A)。流苏茎的电导率整体呈现先升高后降低的趋势(图 1B)，除了对照在处理10天出现最高之外，其他各处理均在处理15天出现最高值；0.4% NaCl处理的电导率在第10天显著升高(P < 0.05)；0.8% NaCl处理的电导率，在处理第15天的变化比较明显，极显著(P < 0.001) 高于第5和第10天，显著高于第20天(P < 0.05)(图 1B)。

经过NaCl处理的流苏，叶的电导率每个时期都高于对照；在处理20天时0.4% NaCl处理极显著高于对照(P < 0.01)，0.8%NaCl和1.2%NaCl处理也都极显著高于对照(P < 0.01)(图 1A)。流苏茎在处理第5和第10天对照的电导率高于其他处理；且在处理10天时，对照显著高于0.8%NaCl处理(P < 0.05)。处理15天，0.8%NaCl处理极显著高于对照(P < 0.01)(图 1B)。

2.2 NaCl胁迫对流苏电阻抗图谱参数的影响 2.2.1 流苏叶电阻抗参数的变化

NaCl胁迫期间，高频电阻率r和胞内电阻率r_i的变化趋势相同，整体趋势是先下降再升高，除了1.2% NaCl处理，其他各处理均在处理第15天出现最低值(图 2A，C)。低频电阻率r₁和胞外电阻率r_e的变化趋势相同，均是先小幅上升后极显著下降(P < 0.001) 而后又极显著上升(P < 0.01)，且各处理均在处理第15天出现最低值(图 2B，D)。弛豫时间τ，整体趋势是先升高后极显著下降(P < 0.001) 后再升高，且各处理均在第15天出现最低值。前10天，各处理有所不同，0.8% NaCl处理呈下降趋势，其他个处理均呈上升趋势(图 2E)。弛豫时间分布系数ψ，对照和1.2% NaCl处理变化趋势一致，呈上升趋势，且均在15天时出现最高值；0.4% NaCl处理和0.8% NaCl处理变化一致，呈降、升趋势(图 2F)。

处理第5天，1.2% NaCl处理的高频电阻率r和胞内电阻率r_i与对照有显著差异(P < 0.05), 0.4%和1.2% NaCl处理的高频电阻率r和胞内电阻率r_i有显著差异(P < 0.05)。处理第10天，0.8% NaCl处理的高频电阻率r和胞内电阻率r_i与对照有显著差异(P < 0.05)，1.2% NaCl的高频电阻率r和胞内电阻率r_i与对照有极显著差异(P < 0.05)。处理第15天，0.4% NaCl处理的弛豫时间τ与0.8% NaCl处理有显著差异(P < 0.05)。处理第20天，1.2% NaCl处理的高频电阻率r和低频电阻率r₁、胞内电阻率r_i、胞外电阻率r\-e与对照有极显著差异(P < 0.01)，0.8% NaCl处理的低频电阻率r₁和胞外电阻率r_e与对照有显著差异(P < 0.05)。

2.2.2 流苏茎电阻抗参数的变化

NaCl胁迫期间，高频电阻率r和胞内电阻率r_i的变化趋势相同，整体呈先下降后上升的趋势，只有对照在处理前10天呈上升趋势。各处理15天相对于处理第5和第10天呈极显著下降(P < 0.001)，而后处理第20天除了1.2% NaCl处理不显著上升外，其他均有极显著上升(P < 0.01)。每个处理均在处理15天时出现最低值(图 3A，C)。

低频电阻率r₁和胞外电阻率r_e的变化趋势相同，整体显先下降后上升的趋势，只有1.2% NaCl处理在处理前10天显上升趋势。每处理15天相对于处理第5和第10天呈极显著下降(P < 0.001)，处理20天有极显著上升(P < 0.001)。每个处理均在处理15天出现最低值(图 3B，D)。

各处理弛豫时间τ均显示先上升后下降而后再上升的趋势。处理15天较处理10天除了1.2% NaCl处理显著下降(P < 0.05) 外，其他各处理均是极显著下降(P < 0.01)。最低值均出现在处理15天，最高值均出现在处理10天(图 3E)。

弛豫时间分布系数ψ整体显示先下降后升高的趋势。各处理第15天较第10天均极显著下降(P < 0.001)，处理20天除了1.2% NaCl处理上升趋势不显著外，其他各处理均极显著上升(P < 0.001)。各处理最低值均出现在15天(图 3F)。

处理第5天，1.2% NaCl处理的低频电阻率r₁和胞外电阻率r_e与对照有显著差异，1.2% NaCl处理与0.4% NaCl处理的高频电阻率r和低频电阻率r₁、胞内电阻率r_i、胞外电阻率r_e均有显著差异(P < 0.05)。处理第10天，1.2% NaCl处理的高频电阻率r和胞内电阻率r_i与对照差异显著(P < 0.05)，0.4% NaCl处理的高频电阻率r和胞内电阻率r_i与1.2% NaCl处理差异极显著(P < 0.01)。处理第15天，1.2% NaCl处理的弛豫时间分布系数ψ与对照差异显著(P < 0.05)。处理第20天，弛豫时间τ，1.2%和0.8% NaCl处理与对照差异显著(P < 0.05)。弛豫时间分布系数ψ，1.2% NaCl处理与0.4%和0.8% NaCl处理差异显著(P < 0.05)。1.2% NaCl处理的高频电阻率r和胞内电阻率r_i与对照和0.4% NaCl处理均差异极显著(P < 0.01)。0.8% NaCl处理的高频电阻率r和胞内电阻率r_i与对照差异显著(P < 0.05)。

2.3 不同时期NaCl处理电阻抗参数与电导率的相关性

对不同时期NaCl处理下的电导率和电阻抗参数进行了对比分析，结果见表 1，2。以电导法测得的电导率为标准，分析电阻抗法测得的各参数与电导率之间的相关性，对于流苏叶片在各时期，高频电阻率r与电导率均呈负相关(r =-0.977~-0.673，R²=0.954~0.533)，且在处理第15和第20天时呈显著负相关。胞内电阻率r_i在第20天以前也存在负相关性(r =-0.945~-0.739，R²=0.926~0.546)，且在第15天呈显著负相关(表 1)。

从整个处理时期来看，流苏茎弛豫时间τ在大部分时期与电导率显负相关(r =-0.903~-0.401，R²=0.980~0.516)(表 2)。

2.4 不同浓度NaCl处理电阻抗参数与电导率的相关性

不同浓度NaCl处理电阻抗参数与电导率关系见表 3，4。以电导法测得的电导率为标准，分析电阻抗法测得的各参数与电导率之间的相关性。流苏叶片高频电阻率r和胞内电阻率r_i与电导率在每个处理都存在相关性。且1.2%NaCl处理，高频电阻率r和胞内电阻率r_i呈显著正相关(r =0.932^*，r= 0.943^*)(表 3)。

流苏茎的电阻抗参数在0.8%NaCl处理下除分布系数ψ外，其他各参数均与电导率存在显著相关性(r =-0.889~-0.998)，其中胞内电阻率r_i和高频电阻率r呈极显著负相关(r =-0.998 ^**)(表 4)。

2.5 通径分析

为进一步明确流苏NaCl胁迫下，电阻抗参数与电导率间的关系，对电阻抗参数与电导率进行了通径分析(表 5)。通径分析是衡量原因变量对结果变量相对重要性的一种多元统计分析方法。由表 5可知：电阻抗参数在整个处理期间，对2年生流苏苗的电导率的通径系数绝对值，由大到小依次是：r_i(1.909)，r (0.885)，ψ (0.691)，r_e(0.394)，τ (0.082)，r₁(0.038)。在NaCl胁迫下，胞内电阻率r_i对电导率的影响最大，通径系数绝对值为1.909；低频电阻率r₁对电导率的影响最小，通径系数绝对值为0.038。

3 讨论 3.1 NaCl胁迫对流苏膜透性的影响

细胞膜透性是评定植物对逆境反应的方法之一，逆境伤害下，往往造成细胞内的物质(尤其是电解质)外渗，引起组织浸泡液的电导率增长(张兆英等，2006)。有研究表明：处于盐胁迫中的植物有一个共同的特征就是膜系统受到破坏，脂膜相对透性增加，离子大量外渗(Dai et al., 2009；李彦等，2008；刘玉汇，2008)。肖雯等(2000)通过对沙枣(Elaeagnus angustifolia)、玫瑰(Rosa rugosa)、枸杞(Lycium chinense)、黄花菜(Hemerocallis citrina)等几种盐生植物的电导率的研究发现，黄花菜的电导率最低。表明在相似的生境条件下，耐盐植物的细胞膜受到的伤害较小。

本试验中叶片电导率(72.39%~99.55%)明显高于茎的电导率(41.83%~78.01%)，说明叶片对NaCl胁迫的感应更为敏感。NaCl处理的叶片在每个时期电导率都高于对照，且在处理20天，NaCl处理的与对照有显著差异，说明在本试验中，NaCl胁迫对流苏叶生长产生不利影响且在处理进行第20天时受害明显。处理前15天，流苏叶片每个时期的电导率最高值均是0.8%NaCl处理，这与李宏等(2009)对盐桦(Betula halophila)幼苗叶片电导率的研究结果部分类似。在前人的研究中，相对电导率在1.6%~1.8%NaCl浓度下最高，且显著高于2.0%~2.2%高浓度NaCl下的相对电导率；丙二醛(MDA)含量的变化与电导率的变化一致。说明在盐胁迫下，一定范围浓度内随着胁迫的增强，MDA含量增加，而超出该浓度范围，MDA含量反而下降。MDA含量越高其膜脂过氧化也就越严重，胁迫的危害程度也越大；MDA的积累能对膜和细胞造成进一步伤害，其含量反映了逆境下细胞膜的稳定性。此外，推测可能由于在短时期，高浓度处理下(1.2%NaCl处理)，植物体内产生较高活性的SOD等能有效清除自由基的物质，从而抑制膜脂过氧化发生，进而短时期内使膜透性增加缓慢。

流苏茎处理前10天，NaCl各处理都低于对照，处理15天后才高于对照，推测在NaC1处理前10天，流苏茎细胞通过避盐和耐盐机制进行自我调节，即通过稀盐作用、泌盐作用和拒盐作用来降低盐分在体内的积累来躲避盐害的发生；通过渗透调节作用，改变代谢途径和激素调节作用等，通过生理或代谢过程来适应细胞内的高盐环境，从而增强植物对盐分的忍耐能力(郑国琦等，2002；吴敏等，2007；聂莉莉等，2008；张丽等，2010)，使茎适应NaC1胁迫从而不被伤害，导致暂时性的电导率数值下降，然而在10天后，自我调节机制逐渐受到破坏，从而使茎受到伤害，导致NaCl各处理高于对照。除了对照NaCl各处理均在处理15天出现最高值，说明处理进行15天时茎对NaCl反应最敏感。0.8%NaCl处理在第10天显著低于对照(P＜0.05)，处理15天又极显著高于对照(P＜0.01)，说明流苏茎对0.8%NaCl处理最敏感。流苏叶片和茎对相同浓度NaCl处理不同表现说明同种植物不同器官对NaC1胁迫的反应是不同的。

3.2 NaCl胁迫对流苏电阻抗参数的影响

在电阻抗图谱参数测定过程中，低频电流不能通过细胞膜，但可在胞外间隙流动，而高频电流不仅可以通过细胞膜，还可在胞外间隙及胞内流动。因此，植株受到胁迫后将导致通过电流发生改变(Repo et al., 1994)，所以电阻抗参数的变化能够较好的反映细胞变化，达到测定抗性的目的。

本试验结果可知：随着浓度的增加，流苏叶片电阻抗参数高频电阻率r和低频电阻率r₁、胞内电阻率r_i、胞外电阻率r_e、弛豫时间τ均出现逐渐减低或先增大后减小的趋势，这与刘晓红等(2009)的研究一致。本试验中当NaCl浓度大于0.8%，高频电阻率r和低频电阻率r₁、胞内电阻率r_i、胞外电阻率r_e、弛豫时间τ都表现为持续减小的趋势。说明流苏叶片最耐NaCl浓度在0.8%左右。流苏叶片的电阻抗参数在不同NaCl处理下，在处理15天时，除了0.4% NaCl处理和0.8% NaCl处理弛豫时间τ有显著差异外，其他处理参数之间无差异。所有参数所有处理浓度，均在处理15天出现最低值，说明在本试验中NaCl胁迫处理到第15天时已经达到流苏的最耐NaCl处理时间。

对于流苏茎，整体看随着浓度的增加电阻抗各个参数变化不如叶片明显，说明同种植物不通器官对NaCl胁迫的变现敏感对不同，叶片较为敏感。随着浓度的增加，流苏茎电阻抗参数高频电阻率r、胞内电阻率r_i、弛豫时间τ均出现逐渐减低或先增大后减小的趋势，这与叶片表现的一致。

3.3 NaCl胁迫流苏电阻抗参数与电导率的关系

本试验发现：在NaC1胁迫下，流苏的电阻抗图谱参数与电导率之间的有着相关性。其中叶片的胞内电阻率r_i和高频电阻率r与电导率的相关性较为明显，茎的胞内电阻率r_i和弛豫时间τ与电导率的相关性较为明显，且在NaCl胁迫下，对2年生流苏苗木的电阻抗参数和电导率进行通径分析，表明胞内电阻率r_i对电导率的影响最大，通径系数绝对值为1.909。

电阻抗图谱参数与细胞的生理结构有着紧密的联系。胞内电阻率r_i与细胞的大小、细胞质、基质的浓度和细胞生理状态的变化有关，当逆境引起共质体离子迁移率减小时，胞内电阻增大(Repo et al., 1994)。在本试验中，无论对照还是NaCl处理的叶和茎的r_i均呈现降—升的趋势，叶在高浓度下，第5天已降至最低值，茎在所有浓度下到15天降至最低值；在各时期NaCl处理的r_i多数显著低于对照的，且高浓度较对照的差异更显著。分析可能的原因是盐分子干扰了植物体内的离子动态平衡(Adams et al.，1992)。由于已经进入到植物体内的盐离子，只有2种措施：一是将其排出，即Na⁺从共质体系统排出到外质体系统，从而降低其在代谢活跃部位的累积；二是将其分隔到代谢不活跃的区域，即，进入共质体内的Na⁺的另一个去向就是被分隔到液泡内(廖岩等，2007)。随着NaCl浓度的升高，胁迫强度加大，Na⁺从共质体系统排出到外质体系统的能力，以及Na⁺被分隔到液泡中的能力均下降，使胞内保留了更多的Na⁺，高频电流更易通过胞内，造成胞内电阻率减小。

流苏对0.8%以上的NaCl浓度胁迫敏感，流苏茎的耐盐性强于叶片；用电阻抗图谱参数可以表征流苏受NaC1胁迫的程度，结合通径分析表明可用EIS参数r_i表征流苏耐盐特性。表明电阻抗图谱法将是流苏逆境胁迫研究的一种有效方法。