葡萄座腔菌属(Botryosphaeria spp.)真菌分布十分广泛，可为害多种树木的枝干及果实, 引起溃疡、枝枯、果腐等，导致用材林材质降级, 经济林产量降低, 景观林观赏性降低，造成严重的危害和经济损失(吴小芹等，2001)。目前对树木溃疡病的防治主要集中在化学施药、抗病种质筛选、营林种植等方面，未能筛选出环保、高效、经济、便利的防治方法(张星耀等，2003)。已有的研究表明:脉冲磁场可致生物的组织、神经、心血管、免疫及消化系统发生变化(Liburdy, 1992); 可以产生强烈的生物效应，影响酶的活性中心，进而影响这些酶参加新陈代谢反应; 导致细胞核碎裂及内部如微管蛋白一些亚显微结构解聚，从而影响或阻止有丝分裂的进行，使生物体内发生各种生理、生化和功能的变化，并表现出频率选择和功率选择性，导致细胞生长周期受抑制，甚至凋亡(刘亚宁，2002)。

由于生物本身具备多种生物电磁特性，人为施加外部电磁场必然会影响树木及其寄生在树木上的各种病原生物的生物效应(刘亚宁，2002)，在特定条件下，脉冲磁场可起到杀抑病原生物或提高林木抗性的目的，加之其对生态环境影响小、用时短、能耗低、经济便利，近些年来被国内外学者广泛研究。

本研究以葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)为试验材料，以脉冲磁场为技术手段处理葡萄座腔菌，研究脉冲磁场对葡萄座腔菌生长及侵染的影响，并从超微结构阐述菌丝的生长变化以及在侵染过程中宿主细胞的反应，逐步探寻脉冲磁场对病原微生物的作用机制。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用葡萄座腔菌，选自中国林业科学研究院国家林业局森林保护学重点实验室。

毛白杨(Populus tomentosa)愈伤组织所用毛白杨采自中国林业科学研究院。取2年生健康枝条，剪成5 cm长的段，经75%酒精30 s，1.0 g·kg^-1升汞6~8 min消毒，用无菌水冲洗3~5次后，取表皮韧皮部(含形成层)，并将其切成6 mm×4 mm大小的块，然后接种到装有50 mL诱导培养基的接种瓶中，形成层紧贴培养基，每瓶接种5块(梁军，2008a)。30天后进行继代培养，连续继代3次及以上，待愈伤组织大约1.2 cm³用于试验。

诱导培养基成分: MS (4.4 g·L^-1 Sigma: M5519)+2, 4-D (2.0 mg·L^-1)+LH (0.5 g·L^-1)+琼脂7 g·L^-1+蔗糖20 g·L^-1, pH 5.8;继代培养基与诱导培养基相比，只将2, 4-D减半，其他不变。

1.2 脉冲磁场装置

试验用脉冲磁场装置的主要可控参数:脉冲前沿宽度，脉冲周期，脉冲个数，停止时间和脉冲串个数。脉冲前沿宽度T₁在0.1~10 ms范围内以0.1 ms为单位可调; 脉冲周期T₂以1 ms为单位可调(最大值为200 ms); 脉冲个数即1个脉冲串内的脉冲个数，以1为单位可调(最大值为100);停止时间即2个脉冲串之间的间歇时间，以1 s为单位可调(最大值为100 s); 脉冲串个数以1为单位可调(最大值为100)。

磁场强度峰值是通过脉冲前沿宽度T₁计算出来的。根据脉冲磁场发生装置，1 ms脉冲前沿宽度时磁场强度峰值为720 Gs; 5 ms脉冲前沿宽度时磁场强度峰值为3 180 Gs; 10 ms脉冲前沿宽度时磁场强度峰值为5 080 Gs。

1.3 试验方法 1.3.1 试验设计

1) 供试葡萄座腔菌菌株在25 ℃条件下于PDA平板(ϕ60 mm)上暗培养24 h，计量菌落直径后，放入脉冲磁场线圈内处理。固定脉冲前沿宽度10 ms，处理时间设15，30，45，60 min4个水平。设无脉冲磁场处理为对照。各处理重复3次，每重复8皿。脉冲磁场处理结束，将各处理置于25 ℃恒温培养箱继续暗培养，观测葡萄座腔菌菌落特征的变化。

2) 葡萄座腔菌接种方法  脉冲磁场结束后，将各处理置于25 ℃恒温培养箱继续暗培养72 h，无菌条件下用灭菌打孔器在菌落边缘打取直径5 mm的菌饼，然后将菌饼贴在愈伤组织上，26 ℃暗培养。其中每皿(ϕ90 mm、2%的水琼脂)均匀摆放5块生长一致的愈伤组织。

1.3.2 指标测定

1) 脉冲磁场对葡萄座腔菌生长的影响  脉冲磁场处理后，将各处理菌落置于25 ℃恒温培养箱暗培养，每隔24 h观察葡萄座腔菌的菌落特征并用十字交叉法测定菌落直径，计算每一时间段的抑菌率(王治江等，2008):抑菌率=(CK菌落直径－处理菌落直径)/CK菌落直径×100%。

2) 扫描电镜观察脉冲磁场对葡萄座腔菌超微结构的影响  脉冲磁场处理结束，在25 ℃恒温培养箱暗培养72 h的菌落边缘无菌切取0.8~1 cm²的数个菌块，迅速投入2%戊二醛固定液中室温固定2~4 h，用0.1 mol·L^-1 pH7.2的磷酸缓冲液(PBS)冲洗干净，1%锇酸后固定1~2 h，0.1 mol·L^-1 pH7.2的磷酸缓冲液漂洗，然后分别用50%，70%，80%，90%，100%的乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换10 min，纯醋酸异戊酯浸泡10 min，CO₂临界点干燥，粘样，离子溅射法镀膜，扫描电镜下观察并照相(康振生，1996)。

3) 透射电镜观察脉冲磁场对葡萄座腔菌超微结构的影响  脉冲磁场处理结束，在25 ℃恒温培养箱暗培养72 h的菌落边缘切取1 mm³的数个菌块，迅速投入2.5% pH7.2戊二醛固定液中室温固定2~4 h，用0.1 mol·L^-1 pH7.2的磷酸缓冲液(PBS)冲洗干净，1%锇酸后固定1~2 h，用0.1 mol·L^-1 pH7.2的磷酸缓冲液漂洗，不同浓度的乙醇脱水，丙酮或环氧丙烷置换，浸透液(包埋液:丙酮=2:1)浸透。然后包埋，聚合，组织修块，超薄切片，醋酸铀和硝酸铅双染色，透射电镜下观察并照相(康振生，1996)。

4) 毛白杨愈伤组织褐化指数的测定  每隔12 h观察并记录愈伤组织的菌丝侵染程度和菌丝的生长情况，参照张立钦等(1989)的分级标准计算褐化指数。

5) 透射电镜观察葡萄座腔菌对毛白杨愈伤组织超微结构的影响  接种葡萄座腔菌后72 h，在愈伤组织接菌面切取2 mm×5 mm的数条愈伤组织，另以未接菌愈伤组织为对照。将所取样品在4%的戊二醛磷酸缓冲液中室温固定12 h，按常规戊二醛-锇酸双固定，经丙酮系列脱水，环氧树脂(Epon 812)进行渗透包埋，超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅染色，透射电镜观察并照相(康振生，1996; 赵仕光等，1998)。

2 结果与分析 2.1 脉冲磁场对葡萄座腔菌生长的影响

脉冲磁场不同处理时间对葡萄座腔菌表现出不同的生长抑制作用，葡萄座腔菌菌落出现不同程度的弱势生长。

由图 1可见:菌落生长48 h，CK、脉冲处理15 min与脉冲处理30 min菌落扩张差异不显著，菌落均为白色，气生菌丝发达; 脉冲处理45 min菌落扩展均值仅为2.18 cm，菌落灰白色，气生菌丝生长稀疏; 脉冲处理60 min菌落全部死亡，菌落灰白色，无典型气生菌丝，葡萄座腔菌受到明显的抑制效应。

菌落生长72 h，CK菌落白色，有发达的生长密集均匀气生菌丝，菌落扩展直径均值为6 cm; 脉冲处理15和30 min菌落灰白色，气生菌丝生长稀疏散乱，平板边缘菌丝密集，由于菌体本身的自我修复作用，菌落扩展直径恢复到与CK相同的菌落直径6 cm，扩展差异不显著; 脉冲处理45 min菌落白色，气生菌丝生长稀疏均匀，菌落扩展直径均值为3.74 cm，菌落生长受到明显抑制。

菌落生长96 h，菌落扩张均达到6 cm，菌落生长差异不显著，与CK相比脉冲磁场处理后的葡萄座腔菌菌落形态和颜色均发生明显衰变，菌落稀疏，菌落灰白色，色泽较暗。

在一定磁场条件下，随着时间的增加，脉冲磁场对葡萄座腔菌生长的抑制作用随之增强(表 1)。菌落生长48 h，脉冲磁场处理45 min的菌落抑制率为54.11%，60 min抑菌率为70.74%;菌落生长96 h, 脉冲磁场处理15和30 min抑菌率为0，45 min抑菌率降低为37.67%，而60 min抑菌效果最好，菌落全部死亡。综合比较脉冲磁场处理60 min对葡萄座腔菌菌落扩展的抑制效果最好。

对葡萄座腔菌菌落的扩展进行方差分析如表 2所示，菌落生长24 h, 葡萄座腔菌菌落直径扩展的F值为0.679，P=0.611＞0.05，说明0 h处理菌落直径扩展无差异; 菌落生长48 h的F值为177.624，P=0＜0.01，说明48 h各处理间菌落直径的扩展有极显著差异; 菌落生长72 h的F值为128.166，P=0＜0. 01，说明72 h各处理间菌落直径的扩展有极显著差异; 菌落生长96 h的F值为12 225.669，P=0＜0. 01，说明96 h各处理间菌落直径的扩展有极显著差异。

对各时间段内葡萄座腔菌菌落直径的多重比较表明:不同脉冲时间处理的葡萄座腔菌在不同生长时间的生长差异极显著，脉冲磁场能明显抑制葡萄座腔菌的生长，脉冲处理时间越长，对葡萄座腔菌生长的抑制效果越显著。

2.2 扫描电镜观察脉冲磁场对葡萄座腔菌超微结构的影响

脉冲磁场处理不同时间后，葡萄座腔菌的形态结构发生了不同程度的改变。CK菌丝分布均匀，菌丝体圆润饱满，粗细均匀一致，结构完整(图 2-1, 2)。脉冲磁场处理15 min菌丝疏松变形，菌丝体褶皱，菌丝细化(图 2-5, 6)。脉冲磁场处理30 min菌丝质地疏松薄化，部分菌丝体表面层状剥脱，局部凹陷(图 2-9, 10)。脉冲磁场处理45 min菌丝体凝聚，部分畸形，局部菌丝出现异常分枝，多数菌丝干瘪，粗细不均，表面粗糙凹陷，有凝集物出现(图 2-13, 14)。脉冲磁场处理60 min菌丝凝聚干瘪，严重畸形，菌丝体褶皱失水、多数散布凝集物(图 2-17, 18)。

2.3 透射电镜观察脉冲磁场对葡萄座腔菌超微结构的影响

脉冲磁场处理后，葡萄座腔菌的细胞结构受到不同程度的损伤。其中CK横切面近圆形，细胞壁、细胞膜结构完整，细胞质清晰、分布均匀(图 2-3, 4)。脉冲磁场处理15 min菌丝横切面近椭圆形，局部细胞器降解，形成空腔(图 2-7, 8)。

脉冲磁场处理30 min菌丝横切面近卵形，隔膜异常，菌丝不规则溢缩，异常分支，细胞膜不清晰，少数细胞器降解，胞内空腔增多，胞内成分紊乱(图 2-11, 12)。脉冲磁场处理45 min菌丝横切面近椭圆形，隔膜、分支发育异常，多数细胞器降解，胞内成分紊乱，局部空腔(图 2-15, 16)。脉冲磁场处理60 min菌丝细胞壁遭到破坏，细胞膜轮廓不清，胞内成分紊乱，胞质不均匀，内含物减少，胞内大面积空腔(图 2-19, 20)。

2.4 脉冲磁场对葡萄座腔菌侵染力的影响 2.4.1 脉冲磁场对葡萄座腔菌致毛白杨愈伤组织褐化指数的影响

毛白杨愈伤组织不接种葡萄座腔菌没有出现受害症状，褐化指数为0。愈伤组织接种脉冲磁场处理的葡萄座腔菌后，与CK相比受害症状不明显，侵染力明显降低，并且褐化指数的变化与受害情况相一致，随着接菌时间的延长呈上升趋势(图 3)。接种24 h愈伤组织即开始表现不同程度的受害症状，随着脉冲时间的延长愈伤组织的受害程度也随之降低，褐化指数梯度降低，脉冲磁场对葡萄座腔菌的抑制效应降低了其侵染能力。其中同一处理条件下的愈伤组织在24~72 h间的褐化指数增长均超过1倍，时间愈长对愈伤组织的伤害愈大，侵染力差异越显著。

脉冲磁场处理45 min对葡萄座腔菌侵染力的抑制效果最好，愈伤组织接种该菌后72 h测定褐化指数仅为26.89%。多重比较研究说明:不同接种时间段内的褐化指数差异显著，因此对愈伤组织的侵染力表现为CK＞脉冲处理45 min＞脉冲处理30 min＞脉冲处理15 min。

对葡萄座腔菌褐化指数进行方差分析，如表 3所示，接种12, 24, 48, 72 h后，各脉冲处理时间处理的葡萄座腔菌之间的侵染力有极显著差异P＜0.001，脉冲磁场对葡萄座腔菌侵染力的抑制效果差异显著。各时间段内葡萄座腔菌褐化指数的多重比较表明:脉冲不同时间对葡萄座腔菌褐化指数的影响存在极显著差异。试验说明:不同脉冲时间处理的葡萄座腔菌在接种毛白杨愈伤组织后不同时间测定的褐化指数随接种后时间的增加而升高; 接种后各时间段内的褐化指数存在极显著差异; 脉冲处理时间越长对葡萄座腔菌侵染力的抑制作用越显著。

2.4.2 脉冲磁场对葡萄座腔菌致毛白杨愈伤组织超微结构的影响

透射电镜观察葡萄座腔菌菌丝在侵染过程中的生长变化以及毛白杨愈伤组织细胞的反应。接种不同处理时间的葡萄座腔菌后，各愈伤组织细胞结构与CK相比均受到不同程度的破坏。如图 4-1~4所示: CK愈伤组织中细胞结构完整、规则，细胞器结构完整; 细胞膜完整、光滑，细胞壁和中胶层正常、胞间连丝清晰可见，无质壁分离现象; 细胞核核膜、核仁结构完整，核质均匀、清晰，可见核仁; 线粒体发育完整，内嵴多而清晰。毛白杨愈伤组织接种无脉冲磁场处理的葡萄座腔菌后，如图 4-5~8所示，愈伤组织内无完整、正常细胞结构; 细胞膜、细胞壁破裂解体，中胶层被分解，内溶物消失，细胞解体死亡; 细胞质、质膜分解，形成团块状或颗粒状染色深的内容物，沉积于细胞壁附近。愈伤组织内可见菌丝横、纵断面，细胞膜轮廓不清，内含物降解、管腔空心化。

毛白杨愈伤组织接种脉冲磁场处理15 min的葡萄座腔菌后，如图 4-9~12所示。细胞解体，细胞完整性遭到破坏，细胞质和线粒体被分解并沉积于细胞壁附近，中胶层被分解，细胞壁颗粒化程度增加并被不同程度分解; 中胶层解体，细胞壁、质膜破裂，细胞壁端有内容物溢出; 崩解的细胞壁周围有大量的菌丝，菌丝横、纵断面结构完整，管腔内细胞结构解体、紊乱，形成空腔。

毛白杨愈伤组织接种脉冲磁场处理30 min的葡萄座腔菌后，如图 4-13~16所示。细胞壁变形，中胶层解体，质膜脱离细胞壁断裂、卷曲并沉积于细胞壁附近; 细胞壁局部缢缩、破裂，质壁分离现象显著，胞壁分层不明显; 胞间连丝解体; 细胞器被分解与颗粒化的细胞质一并沉积于细胞壁附近; 线粒体局部裂解，有内溶物溢出; 细胞内部及细胞间隙均有菌丝生长，菌丝侵入处，细胞壁不均匀加厚，有利于防御菌丝的穿透; 少数菌丝膜结构完整、清晰，多数菌丝空腔，内部结构被分解。

毛白杨愈伤组织接种脉冲磁场处理45 min的葡萄座腔菌后，如图 4-17~20所示。细胞形态正常，质膜开始脱离细胞壁、卷曲，质膜周围出现小囊泡，发生明显的质壁分离现象; 多数细胞器被分解成空腔沉积于细胞壁边缘; 细胞内有较多的颗粒状内溶物; 线粒体完整，嵴减少; 细胞内有少数菌丝生长，菌丝细胞膜、细胞壁结构完整、清晰，少有空腔。

3 结论与讨论

脉冲磁场处理后，葡萄座腔菌菌丝出现不同程度的生长势衰弱; 而CK菌落平坦，菌丝丰富密集。脉冲磁场处理45 min，菌落生长48 h后，菌落生长抑制率为54.11%;其中脉冲磁场处理60 min，抑菌效果最好，可完全杀灭葡萄座腔菌，说明较短时间的脉冲磁场处理即可有效抑制和杀死溃疡病菌。这与Nagy等(2004)、Lipiec等(2004)的试验效果基本一致。其中Nagy等(2004)研究发现，用0.1，0.5和1 mT的磁场处理植物病原真菌Alternaria alternata 和Fusarium oxysporum，菌落的生长降低了10%; Lipiec等(2004)发现用脉冲磁场处理液体培养基中的土豆病原微生物Erwinia carotovora，Streptomyces scabies的数量减少了4 000倍，Alternaria solani的数量减少了30倍。

脉冲磁场对葡萄座腔菌的菌丝形态和细胞结构有显著的破坏作用，导致菌丝粗细不均，皱缩失水，破坏葡萄座腔菌细胞结构的完整性，导致细胞内组分的紊乱、解体，甚至空腔。这可能是由于脉冲磁场与生物系统相互作用的生物学效应所引起。具体表现为脉冲磁场可使生物体表面张力、黏度发生变化，体内水分减少，引起渗透变化(Dorna et al., 2010)，改变生物膜的通透性，H⁺和K⁺电流同时也受到脉冲磁场影响，刺激生物体内蛋白质、酶的活性及代谢加快，从而引起细胞的损伤，甚至导致生物体的死亡(Lipiec et al., 2004)。

毛白杨愈伤组织接种脉冲磁场处理后的葡萄座腔菌与CK相比，其细胞结构受到不同程度的破坏，细胞壁变形、解体，中胶层分解，质膜断裂，质壁分离; 细胞器分解沉积于细胞壁附近，细胞内菌丝降解，管腔空化。脉冲磁场能降低葡萄座腔菌的侵染力。这可能由于病菌侵染寄主后，细胞膜透性上升，对质膜的结构和功能造成不良影响，导致膜结构改变和破坏(梁军等，2008b); 进一步导致寄主细胞质和细胞器的解体，从而导致坏死和细胞死亡(Hu et al., 2003)。

本试验表明:在脉冲前沿宽度10 ms下，不同处理时间的脉冲磁场能有效抑制葡萄座腔菌的生长，由于脉冲磁场的生物效应有滞后、累积和放大等特性(刘亚宁，2002)，随着处理时间的增加，对葡萄座腔菌生长的抑制作用随之增强，同时脉冲磁场也降低葡萄座腔菌侵染寄主的能力。