扩展蛋白（expansin）被认为是植物生长过程中细胞壁伸展的关键调控因子。它是一类植物细胞壁蛋白，在酸性条件下诱导细胞壁伸展并缓和壁的压力（McQueen-Mason et al., 1992）。扩展蛋白的发现起始于1989年Cosgrove对黄瓜下胚轴细胞壁酸诱导伸展的研究（Cosgrove，2000）。在随后的研究中发现扩展蛋白参与各种不同的发育过程，包括种子萌发（Chen et al., 2001）、分生组织动力学（Fleming et al., 1997）、果实软化（Brummell et al., 1999）、根发育（Zhang et al., 2000）、茎伸长（Cho et al., 1997）、叶生长（Pien et al., 2001）、花开放与凋谢（Gookin et al., 2003），以及适应反应（Lee et al., 2001b）。尽管扩展蛋白基因在许多植物组织和器官中表达，但是其中一些表现出器官和组织表达的特异性（Wu et al., 2001）。

扩展蛋白由多基因家族编码。根据编码蛋白序列的相似性，可将扩展蛋白至少分为4类：α-expansin（EXPA），β-expansin（EXPB），γ-expansin（EXLA），δ-expansin（EXLB）（Li et al., 2003）。α-expansin是其中最大的一类，在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有26个成员，在水稻（Oryza sativa）中至少有32个成员。β-expansin与α-expansin约有20%~25%的相似性，在禾本科（Gramineae）植物中大量存在，可调节水稻节间的伸长。γ-expansin的蛋白序列比α-expansin和β-expansin短，不具有成熟蛋白质的完整C末端。δ-expansin能编码较短的蛋白质，该蛋白质与一般扩展蛋白的C末端具有高度的相似性，但缺少一半N末端。Im等（2000）在百日草（Zinnia elegans）初生木质部形成过程中发现扩展蛋白的表达; Gray-Mitsumune等（2004）报道了扩展蛋白在杂交杨（Populus）次生木质部形成中的表达情况。

本研究以实验室前期构建的杉木（Cunninghamia lanceolata）木材形成差异表达基因文库为基础（王桂凤等，2006; 2007; 王桂凤，2008; Wang et al., 2007），利用RLM-RACE技术从发育的木质部成功克隆出可能与形成层分化相关的2个α-expansin基因和1个expansin-like protein基因。这组基因将为系统研究扩展蛋白在木材形成过程中的表达、功能及调控机制提供基础。

1 材料与方法 1.1 植物材料

以生长较快、材性较好的句容0号杉木为材料，根据杉木维管形成层的分化规律，取形成层活动旺盛时期的3年生茎段，剥皮后迅速以液氮速冻，置于-70 ℃备用。

1.2 试剂

GeneRacer^TM RACE-Ready cDNA Kit购自Invitrogen公司，pGEM T-easy Vector购自Promega公司，切胶纯化试剂盒、DNA Marker和DNA Polymerase购自Takara公司，DH5α菌株为本实验室保存。其余试剂均为分析纯。

1.3 总RNA和DNA的分离

杉木木质部总RNA按照Chang等（1993）的CTAB-LiCl沉淀改进法提取，以进一步减少酚类物质的干扰。杉木基因组DNA采用Sambrook等（1989）的CTAB法从幼嫩叶片提取。

1.4 引物的设计与合成

根据本实验室构建的差减文库中获得的3个扩展蛋白uniESTs，以及RACE引物的设计要求，设计引物（表 1），并委托上海赛百盛公司合成引物。

1.5 cDNA的克隆与序列测定

取形成层活动旺盛的杉木茎段的总RNA 2 μg，根据RACE试剂盒说明将其反转录合成cDNA，以该cDNA为模板用5′和3′基因特异性引物及试剂盒自带的RACE引物分别扩增相应全长基因的5′和3′末端。扩增程序为：94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，5个循环; 94 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，5个循环; 94 ℃ 30 s，60~68 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，25个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃保存。退火温度根据所设计引物进行优化，扩增产物经切胶回收后，取50 ng与pGEM-T载体（Promega）连接，插入片段与载体的分子数量比为3:1。取5 μL连接产物转化DH5α感受态受体菌，涂板后37 ℃培养过夜。基于蓝白斑筛选法，从LB平板挑取白色阳性克隆菌落接种到含3 mL LB液体培养液的10 mL管中，37 ℃培养过夜，取1 mL菌液依据Rapid Plasmid Miniprep Isolation（Invitrogen）说明书提取质粒DNA，余下菌液取300 μL加入甘油至终浓度15%，-70 ℃保存。按Applied Biosystems公司的BigDye^R Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit进行5′端单向测序反应，在AB3130xl遗传分析仪上电泳。

1.6 基因组全长扩展蛋白基因的扩增与序列测定

以杉木句容0号基因组DNA为模板，根据已获得的扩展蛋白基因全长cDNA序列，设计全长扩增引物（表 1）。50 μL PCR反应体系：10 μL 5×Primer STAR反应缓冲液，4 μL 2.5 mmol·L^-1 dNTP混合液，1 μL模板基因组DNA，2 μL 10 μmol·L^-1正、反向引物，0.5 μL 2.5 U·μL^-1 Taq DNA聚合酶，石蜡油覆盖。PCR反应条件为：95 ℃变性2 min; 再以94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35次循环; 72 ℃延伸7 min。扩增产物经切胶回收后，取50 ng与pGEM-T载体(Promega)连接。取5 μL连接产物转化DH5α感受态受体菌，涂板后37 ℃培养过夜。基于蓝白斑筛选法，从LB平板挑取白色阳性克隆，提取质粒DNA后，按Applied Biosystems公司的BigDye^R Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit进行5′端单向测序反应，在AB3130xl遗传分析仪上电泳。

1.7 序列的分析

运用DNAMAN5.2软件去除载体序列进行拼接，分析这些基因可能编码的蛋白质序列，在美国国家生物技术信息中心（NCBI）数据库中使用BLASTx工具进行序列比对。进一步应用分子进化遗传分析工具MEGA5构建α-expansin基因的系统进化树（Tamura et al., 2011）。信号肽通过软件SignalP 3.0 Serve (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测。

1.8 表达模式分析

分别提取形成层区域、木质部、针叶、茎尖、根及花粉的RNA，按TaqMan Reverse Transcription Reagents Kit（Applied Biosystem）进行反转录，采用Applied Biosystems公司的Power SYBR Green试剂盒，管家基因Actin作为内参，进行实时定量PCR分析，引物设计见表 1。

2 结果与分析 2.1 扩展蛋白全长cDNA的克隆及基因结构分析

以反转录合成的cDNA为模板，用5′和3′基因特异性引物及试剂盒自带的RACE引物分别扩增相应全长基因的5′和3′末端。3′RACE产物（图 1a）和5′RACE产物（图 1b），切胶回收并克隆测序。最终获得全长cDNA序列：ClEXPA1为1 033 bp; ClEXPA2为1 374 bp; ClEXLA1为1 023 bp。在GenBank中的登录号分别为：EF102108，EF158813和EF192940。

以句容0号反转录合成的cDNA及其基因组DNA为模板，分别扩增全长ClEXPA1，ClEXPA2（图 1c）。测序后用BLAST-2-sequence（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi）比对后发现：ClEXPA1基因组全长1 380 bp，含有3个外显子和2个内含子; ClEXPA2基因组全长1 769 bp，含有4个外显子和3个内含子（图 1d）。与拟南芥的expansin基因结构相比，ClEXPA1具有典型的α-expansin结构，而ClEXPA2具有典型的β-expansin结构。这表明α-expansin和β-expansin进化分离可能发生在被子植物和裸子植物分化之后。

2.2 扩展蛋白基因的序列分析

运用DNAMAN5.2软件将所获得的扩展蛋白基因的cDNA序列翻译成蛋白质序列，ClEXPA1包括编码247个氨基酸的开放阅读框（ORF）区（其中信号肽25个氨基酸残基，成熟蛋白有222个氨基酸残基）和189 bp的3′非翻译区（UTR）及100 bp的5′非翻译区; ClEXPA2包括编码268个氨基酸的开放阅读框（ORF）区（其中信号肽21个氨基酸残基，成熟蛋白有247个氨基酸残基）和510 bp的3′非翻译区（UTR）及81 bp的5′非翻译区; ClEXLA1包括编码272个氨基酸的开放阅读框（ORF）区（其中信号肽26个氨基酸残基，成熟蛋白有246个氨基酸残基）和198 bp的3′非翻译区（UTR）及9 bp的5′非翻译区（表 2）。

BLASTx分析结果表明ClEXPA1，ClEXPA2与α-expansin的同源性很高; 而ClEXLA1则属于γ-expansin类。多序列比对分析表明ClEXPA1，ClEXPA2具有α-expansin典型的序列结构。氨基酸链均含有二十几个残基的信号肽，在近N端富含C（半胱氨酸）残基，含有1个HFD基序，在近C端富含W（色氨酸）残基（图 2）。信号肽分析表明杉木expansins定位于内质网，推测是分泌蛋白。

2.3 α-expansin基因的系统进化树

采用泊松修正法（Poisson Correction Analysis）构建了α-expansin基因的系统进化树（图 3）。根据聚类图可将α-expansin基因大致分为4个亚组。其中，ClEXPA1属于B亚组，与火炬松（Pinus taeda）的EXP1的亲缘关系最近，可能是裸子植物特有的; ClEXPA2分在A亚组，该分支还包括PttEXP1，OsEXP7，AtEXP4，LeEXP1和BnEXP1，它们中绝大部分特异性在次生生长相关组织中表达（Gray-Mitsumune et al., 2004）。Gray-Mitsumune等（2004）报道A亚组基因在次生木质部高丰度表达，且具有特征基序RIPGV与KNFR（图 2）。而ClEXLA1则与α-expansin不同，属于γ-expansin类。

2.4 表达模式分析

扩展蛋白由多基因家族编码，且其相互之间的同源性很高。因此表达分析时，为了排除其他同源基因的干扰，用其相对特异3′非翻译区（UTR）设计引物，分别研究了它们在形成层、成熟木质部、茎尖和针叶中的表达情况（图 4）。ClEXPA1和ClEXPA2具有很相似的表达模式，在细胞活动旺盛的形成层中表达最高，在针叶及茎尖中度表达，成熟木质部表达较低，而根和花粉中几乎不表达; ClEXLA1在形成层及针叶中均有较高的表达，在木质部及茎尖中度表达，花粉中表达较低，而根中几乎检测不到。这表明ClEXPA1，ClEXPA2和ClEXLA1可能参与杉木形成层的分化及木材形成过程。

百日草初生木质部形成过程中也发现expansins表达（Im et al., 2000）。从白杨派杂种（Populus tremula × P. tremuloides）成熟茎干形成层区域分离的蛋白中发现有expansins活性，并且从杨树形成层区域的EST文库中分离了3个α-expansins（PttEXP1，PttEXP2，PttEXP8）和1个β-expansins（PttEXPB1），其中PttEXP1表达丰度最高，Northern-blot杂交及原位RT-PCR均证明PttEXP1在次生木质部中特异表达。应拉木（tension wood）的cDNA文库中也发现与PttEXP1十分相似、高丰度表达的PttEXP5（Gray-Mitsumune et al., 2004）。因此，expansin基因在次生壁形成过程中可能起重要作用。

3 结论与讨论

扩展蛋白（expansin）是一类细胞壁结合蛋白，在一定的pH值下无需任何激活蛋白就可诱导细胞壁的伸展。它是植物细胞增大的主要调节物质，也是控制细胞壁流变性的主要成分（Darley et al., 2001）。Expansin在细胞壁中的纤维素微纤丝和基质多糖交叉处，以一种可逆(非水解)方式作用于微纤丝表面的基质聚合物，使多聚体网络间的非共价键（氢键）断裂，促使聚合物滑动，从而引起细胞壁的伸展（Lee et al., 2001a）。

Expansin在植物细胞壁生长和改造中的作用已通过“功能获得”（gain of function）和“功能丧失”（loss of function）的方法进行了研究。在转基因番茄中抑制和过量表达LeEXP1发现LeEXP1的表达量与果实的软化呈正相关（Brummell et al., 1999）。拟南芥AtEXP10表达的改变调控叶片的生长和花梗的凋亡（Cho et al., 2000）。Rochange等（2000; 2001）在番茄中异源表达CsEXP1得出与expansins体内、体外功能相悖的结果：太过量CsEXP1的表达反而会抑制植株的生长。烟草的分生组织瞬时局部微诱导（transient local microinduction）CsEXP1表达，在叶片发育早期能改变局部叶片的生长，产生形态变异的叶片（Pien et al., 2001）。小立碗藓（Physcomitrella patens）通过同源重组成功获得4个expansins无效突变体（null mutants），但是任何一个基因敲出后的突变体都没有表型变化（Schipper et al., 2002）。转基因OsEXP4水稻，通过反义方法下调其表达发现转基因植株比对照矮; 而正义诱导其表达发现OsEXP4蛋白的水平与秧苗的生长呈紧密相关（Choi et al., 2003）。利用反义表达技术在矮牵牛（Petunia hybrida）中下调PhEXP1导致花瓣瓣片（petal limbs）细胞壁纤维素含量的降低以及表型的改变（Zenoni et al., 2004）。Gray-Mitsumune等（2008）在杂交杨上过量表达PttEXPA1，转基因植株节间长度和叶片减少，叶表皮细胞增大; 转基因系的木质细胞发育也发生了改变，PttEXPA1的表达能够刺激纤维直径生长以及导管分子边缘增大。最近，在烟草中过量表达ClEXP1和ClEXP2产生多效的pleiotropic表型：花形、花色及蒴果均有不同程度的变化; 叶片变大，且比野生型至少多2片; 节间伸长; 高生长和粗生长显著增加（Wang et al., 2011）。与野生型烟草植株相比，35S：：ClEXP1和35S：：ClEXP2转基因植株的纤维素含量分别增加约50%和30%。这表明expansins不仅能够在体内诱导不同组织和器官的扩展（expansion），而且可能通过依赖细胞类型的方式影响次生壁形成过程中纤维素的代谢。

尽管已通过在烟草中过量表达的系统探讨了杉木ClEXP1和ClEXP2的生物学功能，但是它们在木材形成过程特别是细胞分化中的作用仍需通过在杉木体内的抑制表达及过量表达进行功能分析确认。此外，目前对γ-expansin（EXLA）生物功能的探讨还未见报道。通过对ClEXLA1的功能解析可以进一步了解expansin基因在木材形成过程中的作用，也可以探讨expansin基因家族的功能进化，最终为林木的分子育种提供潜在的候选基因资源。