干旱、高盐及极端温度胁迫是影响森林生产力和限制林业生产的主要非生物胁迫因素，也是实施困难立地造林的主要限制因子。国内外研究表明，植物的抗旱、耐极端温度和盐碱等抗逆性状是由多基因控制的数量性状，是多方面、多层次和多途径协同作用的结果，有着非常复杂的调控机制(Zhang et al.，2004; Yue et al., 2006)。最近的研究表明，植物各种诱导型基因的表达主要受特定转录因子在转录水平上的调控，在逆境条件下，抗逆转录因子能够与基因组中顺式作用元件特异结合从而有效转录调控诸多抗逆基因的表达，在抗逆分子育种中显示了前所未有的应用前景(Agarwal et al., 2006)。而目前在分子育种方面的主要进展是通过分子标记辅助选择(marker assisted selection，MAS)策略将影响抗逆性状的多个基因剖分开来。这一方法可以像研究质量性状基因位点一样，对这些数量性状基因位点进行研究，研究基因在染色体上的位置，并寻找与其紧密连锁的分子标记，以通过聚合育种或直接选择等策略来对林木进行抗逆遗传改良(Hospital，2009)。

若有效开展分子标记辅助育种，就需要首先开发理想的分子标记位点。在常见的分子标记技术中，简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)也称微卫星DNA，由于具有多态性高、共显性遗传、检测容易且结果稳定、重复性强等优点，被认为是一种理想的分子标记(Kalia et al., 2011)。但传统方法开发的SSR位点多来自基因组的随机区域，而这些SSR多呈中性进化，与物种表型性状的形成连锁不太紧密(Tuskan et al., 2004)。与此不同，基因内的SSR由于其功能重要性，在进化过程中，一般会受到较强烈的选择压，造成与物种的表型性状紧密连锁(Li et al., 2004)。特别是开发转录因子基因家族内的SSR，并对其在不同物种内的可转移性进行检测是利用该标记技术进行重要抗逆性状分子标记辅助育种的前提。

为此，本研究以能最大程度地反映小叶杨(Populus simonii)自然分布区域的36个基因型个体为材料，在对3个转录因子家族，包括Na⁺/H⁺反向运输蛋白基因(Na⁺/H⁺antiporter，NHX)、脱水响应元件结合蛋白(dehydration responsive element binding protein，DREB)、热激转录因子(heat shock transcription factors，Hsfs)中21个成员序列测定的基础上，发现基因内不同区域SSR位点，并依据SSR位点两侧的保守区域设计SSR扩增引物。在此基础上，以杨属内白杨派(Leuce)、黑杨派(Aigeiros)、青杨派(Tacamahaca)、胡杨派(Turanga)及大叶杨派(Leucoides)内22个基因型个体为试验材料，对开发的31对SSR引物进行了多态性评价。研究结果为利用功能基因内SSR位点进行QTL分析及连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)作图提供了重要的理论依据，具有重要的应用价值。

1 材料与方法 1.1 植物材料

2007年秋季课题组从吉林、辽宁、内蒙古、河北、北京、山东、河南、山西、陕西、青海、甘肃、四川12个省(市、自治区)的小叶杨自然分布区域，共收集保存了560个基因型个体。为发现小叶杨抗逆相关转录因子基因内多态性SSR，选取能最大程度地覆盖小叶杨自然分布区域的36株个体作为试材，摘取新鲜叶片用于基因组DNA提取; 而用于SSR引物在杨属内通用性评价的材料列于表 1，为杨属内22个基因型个体。

1.2 总DNA的提取

总DNA提取按DNeasy Plant Mini Kits(Qiagen，Inc.，Valencia，CA，USA)描述的方法进行。

1.3 SSR位点发现及引物开发

作者所在课题组在进行小叶杨抗逆转录因子基因单核苷酸多态性分析时检测到15个转录因子基因内存在SSR多态性位点，并设计了基因特异的PCR扩增引物。

1.4 SSR位点扩增及电泳检测

根据设计的核苷酸引物对应用25 μL DNA聚合酶链式反应(PCR)体系，以杨属不同种及小叶杨种内不同个体提取的DNA为模板，加入2.5 μL 10×buffer，1.8 μL 25 mmol·L^-1 MgCl₂，1μL 10 mmol·L^-1 dNTP，Taq DNA聚合酶1.0 U(以上试剂购自Promega公司)，10 μmol·L^-1正向和反向引物各1 μL，加适量双蒸水至25 μL。于94 ℃，3 min →(93 ℃，30 s → 56 ℃，30 s →72 ℃，40 s)35个循环→72 ℃，5 min热循环条件下，扩增出预期长度的目的片段。扩增产物加入10 μL Loading buffer(98%甲酰胺，10 mmol·L^-1 EDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚兰)，经变性后在6%的变性聚丙烯酰胺胶上电泳分离，条件是95 W，恒功率电泳约70 min。电泳后采用银染检测方法进行显色观察，记录扩增结果。

1.5 小叶杨自然群体遗传多样性分析

依据36株小叶杨SSR基因型数据，采用POPGENE 1.32程序计算自然群体中等位基因数(N_a)、有效等位基因数(N_e)、观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)与近交系数(F_is)等遗传多样性参数。

1.6 SSR引物的有效性评价

利用开发的SSR引物，检测其在杨属内5个派间与派内不同个体间的有效性扩增，并分析其多态性; 在此基础上，用POPGENE1.32聚类分析软件计算基于Nei’s无偏遗传距离(Nie，1987)，根据遗传距离由PHYLIP中的邻接法UPGMA构建系统聚类图，最终在分子水平上确定杨属内各派间亲缘关系。

2 结果与分析 2.1 检测小叶杨抗逆相关转录因子基因内SSR位点

鉴于植物各种诱导型基因的表达主要受特定转录因子在转录水平上调控这一特点，开发抗逆转录因子基因内发生的SSR多态性位点是进行该物种SSR分子标记辅助抗逆育种的基础。为此，选取了在非生物胁迫如极端温度、干旱及高盐等差异表达的3个基因家族中共21个转录因子候选基因作为目标，对这些基因的启动子、5’UTR、外显子、内含子、3’UTR进行了克隆与测序(表 2)。由表 2可见，分析的这21个转录因子基因长度为708~9 303 bp，共覆盖杨树基因组长度59 389 bp。通过对这21个基因在36株小叶杨基因型个体中的序列比对后共检测到31个SSR位点，SSR出现的频率为1/1 916 bp(表 3)。由表 3可见，开发的这31个SSR位点，分别位于基因的启动子(38.7%)、5’UTR(9.7%)、外显子(22.6%)、内含子(9.7%)及3’UTR(19.4%)(表 3)。在这31个SSR位点中，碱基重复呈现出2~5碱基形式，其中以二碱基重复的位点有16个，占总数的51.6%，且尤以(AT)ⁿ，(CT)ⁿ，(AG)ⁿ较普遍(表 3)。

2.2 SSR位点PCR扩增引物的开发及其有效性验证

为了合理利用检测到的转录因子基因内SSR位点，就需要开发有效扩增这些位点的引物。因此，在SSR位点发现的基础上，依据其两端的保守序列，设计了31对SSR位点PCR扩增引物(表 4)。为了检测这些引物组合在杨属内的通用性及PCR扩增的有效性，以表 1所列的杨属白杨派、黑杨派、青杨派、胡杨派及大叶杨派内22个基因型个体为材料进行了PCR扩增及有效性检测(表 4，表 5)。可见，除引物对SSR17与SSR29仅能在杨属3个派内进行有效扩增外，其他29对引物组合都至少能在4个派内个体中进行有效扩增，占引物总数的93.5%(表 5)。这一结果显示，设计的引物比较理想，同时也推测转录因子基因序列在杨属内的相对保守性。理想的SSR位点不仅要求能够在目标物种中得到有效扩增，更需要它们在杨属派间或派内具有多样性变异。为此，统计了在派间或派内具有多样性扩增的SSR位点数量(表 5)。由表 5可见，仅有2个SSR位点(SSR17与SSR29)分别仅能在白杨派与青杨派1个派内不同个体中显示出多样性，其他位点均至少在2个派内个体间具有多样性。因此，本文在抗逆相关转录因子基因内检测到的SSR位点在杨属内具有较高的多样性。

2.3 SSR位点在小叶杨及杨属内不同个体间的等位变异

检测开发的SSR位点在小叶杨及杨属内不同种间的等位变异是有效利用这些SSR位点的基础，因此，统计了所有SSR位点在小叶杨自然群体及杨属内不同个体间的等位变异。总体上，检测到的这些SSR位点在小叶杨自然群体中展示了丰富的多样性，SSR基元的重复次数变异范围为3~23(表 3)。在此基础上，检测了小叶杨自然群体中的遗传多样性(表 6)，31个位点的有效等位基因数(N_e)为1.672~5.173，平均为3.458;这些位点的观察杂合度(H_o)与期望杂合度(H_e)平均分别为50.6%与69.1%，表明小叶杨群体内因有一定程度自交现象而导致纯合子过量。Shannon信息指数(I)在各位点间较为稳定，均高于1.0，平均为1.457。由表 6可知，近交系数(F_is)中除SSR1与SSR3 2个位点为负值外，其余位点在小叶杨自然群体中均为正值，平均为0.295，显示群体内个体间纯合子过量而杂合体缺失。

若SSR位点处于基因的编码区，则SSR基元是3，以保证密码子编码氨基酸的正确性，如PsDREB8基因编码区域的SSR10位点，在小叶杨自然群体演化过程中密码子ACC形成了4~11次的多样性变异(表 3)。比较了来源于基因内不同区域SSR位点的多样性变异，结果表明，源于基因调控区域如启动子与UTR区域的SSR位点无论在小叶杨种内不同个体间还是在杨属内不同派间均显示出较高的多样性。如位于PsNHX1和PsNHX2启动子区域的SSR位点，AT与CT单元的重复次数均在10以上，显示了启动子区域SSR位点在小叶杨种内具有广泛的遗传变异。而在杨属内不同种间也展示了较为广泛的等位位点多样性，变异范围为3~12个，共检测到189个多样性位点，平均6个(表 4)。

2.4 开发的SSR位点在杨属系统分类中的应用

选取了能在杨属5个派内均能扩增的27个SSR位点来检测杨属内不同种间的遗传进化关系。结果显示，22份供试材料在SSR水平上表现出明显的多态性差异，且可很容易区分出不同派间的杨树个体(图 1)。如图 1A与1B分别用SSR12和SSR29可将杨属5个派内22个基因型个体划分成4类，即青杨派(编号1~6)、白杨派(编号7~14)、黑杨派(编号15~20)、胡杨派(编号21)与大叶杨派(编号22)(图 1)。在此基础上，基于SSR多态性数据对22个供试材料进行了聚类分析(图 2)。由图 2可见，以柳树为外类群，所有杨属个体聚在一起，且可明显区分成5个亚分支，相应于杨属5个派，其中青杨派与黑杨派首先聚在一起，然后依次分别与胡杨派及大叶杨派聚为一个大的分支，而白杨派与其他4个派系的亲缘关系则较远。在此基础上，计算了个体间的遗传距离及遗传相似系数。本研究对杨属内22个基因型个体的聚类结果与常规分类一致，即各派在杨属中是明显独立的，黑杨派、青杨派、胡杨派及大叶杨派亲缘关系较近，与白杨派亲缘关系较远。

3 讨论

随着全球气候变化和生态环境日益恶化，研究植物抵御不同非生物胁迫的分子遗传调控机制就成为国际研究热点(IPCC，2007)。为此，先前已在模式植物和主要农作物中广泛开展了基于QTL作图的分子标记辅助选择育种，并取得显著进展(Kalia et al., 2011)。而对于林木，已在杨树、桉树和松树等主要用材树种中检测到了控制木材纤维品质如纤维素含量、纤维长度和宽度等性状的QTLs(Grattapaglia et al., 1996; Sewell et al., 2002; Zhang et al., 2006; Thumma et al., 2010)。这些研究虽然大大提高了人们对复杂数量性状结构的认识，如控制这些性状的QTLs的数量、大小及其互作方式，但由于树木本身具有高度杂合、树体高大、生长周期较长、多为异交等特性，很难像模式植物或农作物那样构建足够大的理想的近交系作图群体。其中原因之一所用标记大多为显性标记，有限的标记数量和性状在群体中的变异幅度很小，且这势必导致QTLs的分辨率低、准确性差等缺陷。因此，在林木中很难将所检测到的QTLs应用于标记辅助选择来提高遗传增益或进行图位克隆。

而SSR作为一种分子标记技术，与其他标记如RFLP，RAPD及AFLP等相比，具有多态性高、共显性、DNA用量少、实验重复性好、结果可靠等优点，并已利用基因组插入文库筛选法、微卫星富集法及数据库生物信息学搜索法在林木中开发了一批SSR标记(Tuskan et al., 2004; Yasodha et al., 2008; Yin et al., 2009)。但由于先前开发的这些SSR位点多来自基因组的随机区域，可能在物种的系统演化、指纹图谱绘制与种质鉴定等领域具有较好的应用前景，但在SSR标记辅助选择育种实践中则经常会出现4方面的问题:一是随机区域特别是基因间隔区虽可检测到较多的SSR位点，但由于这些区域的保守性较低，则会造成在一个物种中开发的SSR标记很难在近缘物种中得到有效利用; 二是这些SSR多呈中性进化，很难检测到与表型性状显著连锁的SSR位点(Vasemägi et al., 2005); 三是即使检测到与目标性状连锁的SSR位点，但由于SSR位点与控制目标性状的基因连锁比较松散，在未来1~2代杂交育种中就会造成标记与基因间的分离; 四是随机开发的SSR标记位点一般解释表型遗传变异的比例较少，很难对目标性状进行直接选择。功能基因组学研究表明，植物的抗旱、耐极端温度和高盐等抗逆性状是由多基因控制的数量性状，且控制抗逆基因的表达主要受特定转录因子在转录水平上的调控(Agarwal et al., 2006)。在逆境条件下，一个抗逆转录因子能够与基因组中含有特定顺时作用元件结合从而有效转录调控诸多抗逆基因的表达。因此，若能大规模开发抗逆转录因子基因调控或编码区的SSR位点，将会在抗逆性状标记辅助选择或分子育种中发挥作用。

本文以我国乡土抗逆树种小叶杨为模式，首次在林木中报道了3个抗逆转录因子家族共21个基因成员中开发的SSR位点。通过对36个小叶杨基因型个体，21个候选基因的启动子、5’UTR、外显子、内含子及3’UTR分析，共检测到了31个多态性SSR位点(表 3)。由于功能基因在物种系统演化过程中受到较强的选择压，造成基因位点序列的保守性，SSR位点在21个转录因子基因内出现的频率较低，为1/1 916 bp(表 2，表 3)。与先前在青杨派树种毛果杨(P. trichocarpa)中开发的SSR标记相比，具有明显的优点。优点之一是本文报道的是多态性的SSR位点，而在毛果杨中是基于一个基因型个体检测到具有简单序列重复的SSR位点，在不同基因型个体中不一定具有多态性(Tuskan et al., 2004; Yin et al., 2009); 优点之二是基因内开发的SSR标记能够扩展应用到同一属内不同亚属甚至同一科内。本文开发的SSR标记中，93.5%的位点能够在杨属内至少4个派内不同树种中有效扩增，且在派内不同个体中显示了广泛的遗传变异，共检测到189个多样性位点，变异范围为3~12个。虽然目前基于表达序列标签(expressed sequence tag，EST)开发的SSR标记在群体遗传学及标记辅助选择育种研究中也显示了强有力的生命力，但也存在明显的不足之处，如真核生物基因内一般会存在1个至多个内含子，基于EST开发的引物对经常会落在内含子与外显子的剪切位点而不能得到扩增，在数据分析时被误认为是零等位(null allele)，从而造成错误的结论(Ellis et al., 2007)。