林业科学  2011, Vol. 47 Issue (5): 171-176   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20110529
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文章信息

刘静, 黄艳艳, 翁曼丽, 罗磊, 张虹, 王长宪, 牛庆霖, 冯殿齐
Liu Jing, Huang Yanyan, Weng Manli, Luo Lei, Zhang Hong, Wang Changxian, Niu Qinglin, Feng Dianqi
TCS基因转化泡桐及抗病能力
Transformation of TCS Gene to Paulownia elongata and Its Virus Resistance
林业科学, 2011, 47(5): 171-176.
Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(5): 171-176.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20110529

文章历史

收稿日期:2010-06-03
修回日期:2010-11-30

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刘静
黄艳艳
翁曼丽
罗磊
张虹
王长宪
牛庆霖
冯殿齐

TCS基因转化泡桐及抗病能力
刘静1, 黄艳艳1, 翁曼丽2, 罗磊1, 张虹1, 王长宪1, 牛庆霖3, 冯殿齐1    
1. 泰山林业科学研究院 泰安 271000;
2. 中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101;
3. 山东农业大学 泰安 271018
关键词:泡桐    TCS基因    农杆菌介导    稳定性    病毒抗性    
Transformation of TCS Gene to Paulownia elongata and Its Virus Resistance
Liu Jing1, Huang Yanyan1, Weng Manli2, Luo Lei1, Zhang Hong1, Wang Changxian1, Niu Qinglin3, Feng Dianqi1    
1. Taishan Institute of Forestry Science Tai'an 271000;
2. Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences Beijing 100101;
3. Shandong Agricultural University Tai'an 271018
Abstract: In this study, the trichosanthin (TCS) gene, which was cloned from Trichosanthes kirilowii, was transformed into Paulownia elongata through agrobacterium-mediated method. The conversion rate was 29.2% with 86 transformed strains obtained. The target gene had approximately 50% positive expression rate in plantlets through 11 times subculture and PCR detection for 4 times. And the PCR detection of the plants in field showed that the positive rate was between 40% and 50%. No positive expression of the labeled product of witches' broom was found in the transformed plants after infection susceptible experiment and molecular detection, meanwhile, the virus infection rate of the control was up to 15.0%. Thus, it indicated that, compared to the control, the transformed plants showed higher resistance to the witches' broom disease.
Key words: Paulownia elongata    TCS gene    agrobacterium-mediated    stability    virus resistance    

泡桐(Paulownia)是经济价值较高的优良绿化造林树种。由于丛枝病的危害,每年我国林业的直接经济损失就高达数千万元,并且严重影响农民种植泡桐的积极性(杨俊秀等,2007)。近年来,人们对丛枝病的发病机制和防治方法进行了大量研究(范国强等,2003a),但仍未研究透彻。随着分子生物学的深入发展,植物分子遗传转化技术已成功地应用于多种植物的品种改良和病虫害防治(王学聘等,1997; Tzvi et al., 1998),为泡桐育种开辟了一条全新的途径(钟启宏等,1994; 何泼等,1999; 杜涛等,2005)。核糖体灭活蛋白RIP (ribosomeinactivating proteins)是一种广泛存在于高等植物中的蛋白质,RIP可以分成2类:一类是单链蛋白(TypeⅠ),另一类则是双链蛋白(TypeⅡ)。TypeⅡ是由功能与TypeⅠ蛋白基本相同的肽链A和具有凝集素活性的肽链B通过二硫键相连形成(Frigerio et al., 1998)。现在对转基因植物进行的抗病试验大都使用TypeⅠ核糖体灭活蛋白基因。天花粉蛋白(trichosanthin)是从中药栝楼(Tricosanthes kirilowii)块根中分离得到的一种TypeⅠ核糖体灭活蛋白,由于能特异地抑制原核生物的蛋白质复制过程,从而抑制病毒的生长和繁殖,是一类广谱抗病毒基因,已成功应用于植物抗病毒育种(鲍一明等,1992; 徐琼芳等,1994; 郑洪刚等,1994)。本研究将天花粉蛋白基因TCS,通过农杆菌介导法成功转入泡桐,并对转化株系的遗传表达与抗病毒能力进行研究,经筛选出抗病性较强的转化泡桐优良株系,为进一步工厂化育苗奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

抗病基因天花粉蛋白基因(TCS),由中国科学院生物与发育研究所翁曼丽研究员分离克隆并提供。该基因是从pBITG24-TCS中亚克隆到目前更广泛应用的、而且商品化生产的新载体pCAMBIA2300中,建成的表达载体被命名为pCAMBIA2300-TCS,简称p2300-TCS。在亚克隆时,将含有TCS基因的片段(1 190 bp)插入载体pCAMBIA2300的SmaⅠ-XbaⅠ位点。农杆菌介导基因转化试验在泰安市泰山林业科学研究院生物技术中心进行。外植体取自于生长良好、无病害的兰考泡桐(Paulownia elongata)的种球,取萌发后1~2 cm的幼苗进行继代培养获得快繁体系。以健壮瓶苗的愈伤组织、茎段、茎尖作为基因转化的受体。转化采用的培养基为MS + BA1.0 mg·L-1 + NAA0.025 mg·L-1 (pH5.8),大田苗来自于泰山林业科学院试验苗圃内半年生苗木。

1.2 试验方法

1) 农杆菌介导TCS基因转化试验  采用常规农杆菌介导法,设计4因素3水平的优化转化体系,设计方案见表 1。按照试验设计剪取泡桐茎尖、茎段及愈伤组织,刻伤后分别接种在分化培养基上进行预培养3~9天。用无菌水将含有TCS基因的农杆菌菌液稀释10倍,将经过预培养的材料浸泡在稀释液中10~20 min,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,转入分化培养基上暗培养2~4天。将农杆菌浸染后的试材置于不同光照条件下共培养后,取出后用无菌水冲洗并转接于含有Kan (50 mg·L-1)抗生素的培养基上培养,培养温度25 ℃,光照2 000~10 000 lx。培养30天后统计死亡率、分化率、分化数、苗高等,每因素组合重复3次,结果用加权平均法得出,筛选优化方案,对经抗生素筛选出的苗木进行PCR检测。

表 1 正交试验设计L9(34) Tab.1 Orthogonal design L9(34)

2) 转化株系的稳定性检测  将第1次转化并检测到目的基因的株系继代扩繁6次,后进行PCR检测; 再将第2次检测到目的基因的株系继代扩繁3次,共继代11次,培养360天后进行PCR检测; 同时对大田苗进行PCR检测。采用CTAB法分别提取转化植株和未转化植株的总DNA,并以TCS基因两端的核苷酸序列为引物进行特异序列的PCR扩增。引物1: 5'-GTTTATCAAAGAAGGCCCGA-3';引物2: 5'-CGTACGTAGCTTGAAGTTA-3'。反应体系为:94 ℃、4 min,94 ℃、45 s,55 ℃、45 s,72 ℃、70 s,34个循环,最后在72 ℃延伸5 min。扩增产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。

3) 转化株系抗病能力  进行泡桐丛枝病原菌感病接种。具体方法:剪取野外发病严重的泡桐疯枝嫩枝叶,取回后用清水冲洗并消毒,用研钵将其研碎,取汁液备用; 再取转化组培苗和对照未转化苗用刀片划伤,浸蘸病毒菌液,放入不含Kan的继代培养基(MS + BA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.025 mg·L-1,pH5.8)中培养,1年后利用植原体16S rRNA基因的通用引物,对浸蘸病毒菌液的苗木DNA进行PCR扩增,用大田采集疯枝嫩枝叶的DNA做阳性对照,调查感病率。

2 结果与分析 2.1 农杆菌介导基因转化

1) 优化农杆菌介导TCS基因的转化体系  采用根癌农杆菌介导法进行转化,具体操作如下:将无菌材料按照试验设计剪取,刻伤后分别接种在分化培养基上进行预培养3~9天。用无菌水将含有TCS基因的农杆菌菌液稀释10倍,将经过预培养的材料浸泡在稀释液中10~20 min,取出叶片,用无菌滤纸吸干后,转入分化培养基上暗培养2~4天。转化材料与农杆菌共培养后,即可看到叶片边缘有乳白色的农杆菌菌落出现,用无菌水冲洗叶片,然后用无菌滤纸吸干。将叶片转移到加有Kan抑菌分化培养基上,在光照2 000~10 000 lx,25 ℃条件下进行抗生素筛选培养。

经Kan培养基筛选30天后调查,统计死亡率、分化率、分化数、苗高、绿苗率,结果见表 2。农杆菌浸染TCS基因后经Kan(50 mg·L-1)筛选,以组合8死亡率最高,第1,2,3,4和6组合成活率较高; 第1,2,3,4组合分化率最高,均为100%;分化数以第1组合最高,即选取部位为茎尖,预培养3天,DNA菌液浸染10 min,在黑暗条件下培养分化数值最大为5.08;苗高生长最高的是第3组合,即试材为茎尖,预培养9天,浸染时间20 min,苗高3.54 cm; 以茎尖为试材的3个组合苗高居前3位。绿苗率以第4组合为最高,即以茎段为受体,预培养3天,浸染15 min,绿苗率为94%。

表 2 农杆菌介导TCS基因于含有Kan的培养基筛选(30天)结果 Tab.2 Results of the infection of TCS gene in medium with Kan after 30 days

2) 转化植株的鉴定  经PCR扩增检测,有86个株系得到与目的基因TCS(1 190 bp)片段大小一致的特异性条带,初步证明外源基因已经整合到泡桐基因组中(图 1)。选取对PCR强阳性的7个转化植株进一步进行PCR-Southern杂交检测,结果表明所有植株都显示较强的杂交信号,而未转化的植株没有检测到杂交信号(图 2)。上述2项分子检测结果表明,TCS基因已整合到泡桐基因组内。

图 1 农杆菌浸染后的PCR检测 Figure 1 Results of PCR detection after infection 13,52,91:DNA标准分子量DNA marker; 9,22,44,59,86,93:质粒DNA (阳性对照) Plasmid DNA (positive control); 26,39,65,78,94:水(对照) Water(control); 75,76,77:非转基因植株(阴性对照) Untransformed plants(negative control); 其他为转基因植株Others are transformed plants.
图 2 转化植株的PCR-Southern检测 Figure 2 PCR-Southern detection of transformed strains 1: DNA标准分子量DNA marker; 2,3,5,6,7,8:转基因植株Transformed strains; 4:质粒DNA(阳性对照) Plasmid DNA (positive control).
2.2 转化株系的稳定性检测

1) 转化株系分离筛选  从第1次PCR检测结果得出,泡桐农杆菌基因转化,转化率为29.2%。将其中表达最好39个株系进一步置入含Kan(50 mg·L-1)分化培养基中分离培养,继代培养360天后调查出,首次经PCR检测的转化泡桐株系有嵌合体现象存在,经在含有Kan分化培养基中分离筛选培养360天后,转化株系保存率为58.9%,抗Kan稳定率在48.9%,单株最大分化株数14株,单株平均分化株数9.7株; 有9株(43.5%)的株系中含有目的基因。从筛选的转化株系PCR检测结果看出,阳性表达较强的系号有6个,分别为P9,P55,P60,P65,P102,P254,作为继续筛选试验的转化株系。

2) 转化株系纯化与优良株系的筛选  选择来自P9纯化株系的P128,P129号单株、来自P55纯化株系的P85号单株,放入不含Kan的培养基中进行组培扩繁,培养基配方不变,继代培养180天后,进行PCR检测。

表 3 各转化株系PCR检测结果 Tab.3 Results of PCR detection of the transformed strains

表 4可得出:从快繁生长速度来看,以P129表现最好,180天可继代扩繁58个优良单株,平均每个继代周期(按60天计算)繁殖系数达到9.67株; 可将该株系确定为田间释放的优良品系。

表 4 优良转化株系的筛选及PCR检测结果 Tab.4 Results of the screening and PCR detection of the excellent transformed strains
表 5 优良转化株系继代培养PCR检测 Tab.5 Results of PCR detection of the excellent transformed strains

3) 优良转化株系分子测定  将第3次从P129检测到强阳性株系P31继续继代培养120天,抽取16株进行第4次检测; 同时将P31株系扩繁生根,部分生根苗移栽大田,随机抽取20株组培苗和大田苗进行第5次检测。从表 6结果可知:转化泡桐在实验室内分离纯化11次(660天)后,阳性表达仍在50%左右,在田间的表达在40%~50%之间。

表 6 转化株系抗病能力测定 Tab.6 Detection of the resistance of the transformed strains
2.3 转化株系抗病能力分子测定

对转化植株与对照植株(瓶苗)人工接种泡桐丛枝病植原体,培养240天后利用山东农业大学提供枣疯病植原体16S rDNA引物序列5'-CATGCAAGTCGAACG GA-3'; 5'-CTTAACCCCAATCATCGAC-3',进行PCR分子检测植原体标记产物,调查感病率。从表 6可知:接种病毒的转化植株叶片未发现病毒感染的典型症状,生长势较强,而对照苗(未转基因)发现1株感官表现叶片褪绿、小叶、生长势弱等症状。对感病试验的植株进行PCR分子检测,结果表明:转化植株未发现泡桐丛枝病植原体标记产物的阳性表达,未转化植株有3株出现丛枝病植原体阳性表达,病毒感染率达到15.0%,说明转化植株较未转化植株对丛枝病植原体表现出较高的抗性。

3 结论与讨论

寻找具有广谱抗性的基因是利用基因工程手段获得抗真菌的转基因植物的首要任务(Jach et al., 1995)。研究表明:多种来源的核糖体灭活蛋白(RIP)基因具有上述广谱抗性(Wang et al., 1998),而天花粉蛋白是从中药栝楼块根中分离得到的一种RIP蛋白。在转天花粉蛋白(TCS)基因烟草中,该基因的表达具有抗病毒作用(Lam et al., 1996)。天花粉蛋白不仅对某些植物病毒具有抗性,而且在体外对多种真菌也具有抗性。本研究利用农杆菌获得的转天花粉蛋白基因泡桐植株的抗病结果,表明转TCS基因泡桐对丛枝病具有一定的抗性。

图 3 未转化组培苗感病后的PCR扩增产物 Figure 3 Products of the PCR amplification of the untransformed plantlets after infected 1-4:未转化组培苗感病后的PCR扩增产物Products of the PCR amplification of the untransformed plantlets after infected; 5:DNA marker,DL2000;8:对照Control; 6,7,9:野外大田疯树病枝的PCR扩增产物(植原体病毒DNA) Products of the PCR amplification of the field branches infected with witches' broom.

近年来,国内外关于天花粉蛋白基因转化植物的相关研究报道,其植株转化率大多较低,如徐琼芳等(2001)在小麦(Triticum aestivum)上的转化率为0.49%,Jiang等(1999)使用pBI121-2载体在番茄(Solanum lycopersicum)上的转化率为0.72%。本研究利用农杆菌介导法进行TCS基因转化泡桐,经过多轮分离选择并使用适合浓度的抗生素筛选转化体,减少了假阳性和逃逸现象的发生,转化率达到29.2%;将5个最优组合比较分析发现,选取茎尖作为转化材料,预培养3天,浸染时间15 min,半黑暗条件下的转化效率最高。分析结果表明:浸染部位是影响转化的最主要因子,其次是预培养天数,浸染时间和共培养光照条件影响最小。经对转化株系的分子研究,发现泡桐TCS基因转化嵌合体现象较为严重。对转化泡桐株系分离纯化11次后,分子检测阳性表达仍在50%左右,田间遗传表达在40%~50%之间,这可能与植物生长特性和外源基因嵌入位置有一定关系,还需要进一步探讨。在转基因植物中,RIP蛋白对宿主植物的毒性是表达RIP蛋白面临的另一重要问题。美洲商陆(Phytolacca americana)抗病毒蛋白(pokeweed antivirus protein,PAP)在转基因植物中低水平表达时,可以提高植物对病毒的抗性而不对宿主产生明显伤害,但高水平表达可以引起严重损伤(Wang et al., 1998)。但在本研究中,转天花粉蛋白基因植物在生长过程中没有发现任何明显异常,说明天花粉蛋白基因的表达对泡桐植株的生长无显著影响,这或许是因为泡桐对RIP蛋白的作用不敏感。经转化泡桐组培苗抗病能力初步测定,转化泡桐具有一定的抗病性。由于本试验材料采用组培无菌瓶苗,本身抗病毒能力较强,因此还需要进一步经大田接种抗病试验才能确定抗病性。

由于目前国内外无泡桐丛枝病植原体体外成功培养的报道,本研究通过离体研磨的植原体浸染转化植株,其植原体的生理状态及活性与自然条件下的植原体可能有一定的差异,研究方法还需要进一步探讨,同时对转化株系病毒抗性的遗传有待于证实。

参考文献(References)
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