林业科学  2011, Vol. 47 Issue (5): 82-86   PDF    
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周秀华, 宋瑞清, 曹翠, 崔磊, 梁晓东, 潘建中, 朱元金, 胡振宇
Zhou Xiuhua, Song Ruiqing, Cao Cui, Cui Lei, Liang Xiaodong, Pan Jianzhong, Zhu Yuanjin, Hu Zhenyu
落叶松八齿小蠹伴生真菌3个菌株的鉴定及生物学生理学特性
Identification and Biological and Physiological Characteristics of 3 Fungus Strains Associated with Ips subelongatus
林业科学, 2011, 47(5): 82-86.
Scientia Silvae Sinicae, 2011, 47(5): 82-86.

文章历史

收稿日期:2011-01-04
修回日期:2011-01-28

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周秀华
宋瑞清
曹翠
崔磊
梁晓东
潘建中
朱元金
胡振宇

落叶松八齿小蠹伴生真菌3个菌株的鉴定及生物学生理学特性
周秀华1,2, 宋瑞清1,3, 曹翠1, 崔磊4, 梁晓东5, 潘建中5, 朱元金5, 胡振宇5    
1. 东北林业大学林学院 哈尔滨 150040;
2. 长春大学生物科学技术学院 长春 130012;
3. 黑龙江省林业科学院 哈尔滨 150081;
4. 哈尔滨工业大学食品科学与工程学院 哈尔滨 150010;
5. 黑龙江省佳木斯市孟家岗林场 桦南 154411
摘要: 从落叶松八齿小蠹各虫态体内外、坑道及木材蓝变部位获得3株与落叶松八齿小蠹伴生的真菌,该3株菌可导致木材变色,与蠹害的发生存在密切关系。通过菌体的培养特性和形态观察、放线菌酮耐性及rDNA ITS序列测定,将3菌株确认为Ceratocystis fujiensis,为国内新记录种。3个菌株生长的最佳环境条件:温度为25 ℃,光照为全黑暗条件,pH值为5. 0;最佳营养条件:培养基为PDA +落叶松韧皮培养基,碳源为蔗糖,氮源为酵母粉。3个菌株均具有较强的高温和低温耐受性,能够适应北方较大的温差,树体内的黑暗和酸性条件也比较适合菌株的生长。3个菌株对寄主落叶松具有明显的营养选择性,可利用的碳源种类较多,有机氮源利于菌株生长。
关键词:落叶松八齿小蠹    伴生真菌    Ceratocystis fujiensis    生物学特性    生理学特性    
Identification and Biological and Physiological Characteristics of 3 Fungus Strains Associated with Ips subelongatus
Zhou Xiuhua1,2, Song Ruiqing1,3 , Cao Cui1, Cui Lei4, Liang Xiaodong5, Pan Jianzhong5, Zhu Yuanjin5, Hu Zhenyu5    
1. Forestry College, Northeast Forestry University Harbin 150040;
2. Bio-Scientific and Technical College, Changchun University Changchun 130012;
3. Heilongjiang Forestry Academy of Science Harbin 150081;
4. School of Food Science and Engineering, Harbin Insititute of Technology Harbin 150010;
5. Mengjiagang Forest Farm of Jiamusi, Heilongjiang Province Huanan 154411
Abstract: Three fungal strains associated with Ips subelongatus were isolated from the blue-stain tissue, inside and surface of the body of Ips subelongatus. The fungal stains can cause wood sapstains which associate with the bark beetle attacks. According to culture and morphology characteristic, cycloheximide tolerance and rDNA ITS molecular sequence, the three strains were identified as Ceratocystis fujiensis M. J. Wingf. which is a new record species in China. The optimum conditions for strains growth were as follows: temperature was at 25 ℃, in complete dark, with pH value 5. 0, medium was PDA plus larch phloem extract, supplemented with carbon source of sucrose and nitrogen source of yeast. The three strains had strong tolerance to high and low temperature, so the strains were able to adapt to the larger temperature scale in the north. Dark and acidic conditions in trees were suitable for the growth of strains. C. fujiensis was highly selective to host larch nutrition, and the strains could utilize many kinds of carbon source, but preferred organic nitrogen source.
Key words: Ips subelongatus    associated fungus    Ceratocystis fujiensis    biological characteristics    physiological characteristics    

落叶松(Larix spp.)由于其抗旱、耐寒、生长快、木材价值高,成为我国速生丰产用材林基地建设的首选树种之一,并形成了大面积的人工纯林,广泛分布于东北、华北、西北等省。落叶松八齿小蠹(Ips subelongatus)是我国北方的一种重要蛀干害虫,主要危害落叶松,作为次期性害虫的先锋种侵害新伐倒木、濒死木,在发生盛期可危害健康或生长衰弱活立木。2003年我国落叶松八齿小蠹的发生面积2 895 hm2,给落叶松人工林的经营造成了巨大损失,国家林业局将其定为林业危险性有害生物(杨静莉等,2007)。

在植物-小蠹虫-伴生真菌系统中,伴生真菌对于削弱寄主树木抗性、协助小蠹虫侵害树木起着重要的作用(叶辉,1997; Klepzig et al., 2004; 吕全等,2008)。在众多的伴生真菌中,Ceratocystis属真菌的小蠹虫携带率比较低,但是它们对于寄主树木往往表现出较强的致病力(鲁敏等,2008)。

本研究对落叶松3个伴生菌株的分类地位、生物学及生理学特性等进行了初步研究,为今后致病机制、与落叶松八齿小蠹伴生机制以及二者可持续控制技术的研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

供试菌株:CF1于2008年8月分离自内蒙古扎兰屯市南木林场落叶松八齿小蠹体表,寄主为兴安落叶松(Larixgmelinii); CF2于2009年7月分离自黑龙江省孟家岗林场落叶松八齿小蠹体表,寄主为长白落叶松(L.olgensis),CF3于2009年7月分离自该林场落叶松八齿小蠹坑道内,寄主为长白落叶松。3个菌株均保存于东北林业大学森林病理实验室。

试验所用的基础培养基为PDA综合培养基(配方为:马铃薯200g,葡萄糖20g,KH2PO43g,MgSO4 1.5g,琼脂20g,蒸馏1 000 mL,pH自然)、MEA培养基(配方为:麦芽浸膏30g,大豆蛋白胨3g,琼脂15g,双蒸水加至1 000 mL,pH 5.6 ± pH 0.2)、Czapek’s Agar培养基(配方为:NaNO3 2g,K2HPO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g,KCl 0.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖30g,琼脂20g,蒸馏水1 000 mL,pH自然)。将供试菌株在PDA综合培养基上培养3天,试验所用培养皿直径均为9 cm。

1.2 菌株分类地位的鉴定 1.2.1 菌株培养特性

无菌条件下,分别用直径10 mm的无菌打孔器切取PDA综合培养基上培养3天的供试菌株菌落,分别接种于PDA、MEA平板培养基中央,每个处理设5个重复,置于25 ℃下暗培养,记录菌落形态、气生菌丝生长状况,采用十字交叉法测量菌落生长速度。

1.2.2 放线菌酮耐性

在MEA培养基内按照0.05,0.1和0.5g· L-1的浓度添加放线菌酮,于25 ℃按照上述方法培养,测量菌落生长速率。

1.2.3 菌株形态学

在显微镜下观察3个菌株的子囊壳、子囊、子囊孢子、分生孢子梗、分生孢子的形态特征,并进行描述、测量和拍摄。

1.2.4 菌株rDNA ITS序列的测定

取50 mg菌体,加液氮研磨成粉末状,采用CTAB法提取DNA,ITS序列扩增引物为: 5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3' (ITS1)和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(ITS4),由大连宝生物有限公司合成。建立50 μL的PCR反应体系:模板40 ng,Taq DNA聚合酶终浓度为0.4 U,4种dNTP各0.3 mmol·L-1,引物各0.1 μmol·L-1。扩增程序为:94 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s,58℃ 45 s,72 ℃ 90 s,循环30次; 72 ℃ 10 min。对PCR扩增产物进行测序,由上海生物工程有限公司完成。将测得的ITS序列在GenBank进行比对,对获得的同源序列进行序列分析。与其亲源关系较近的物种,研究其中的系统发育关系,建立系统发育树(刘芳等,2010; 宋瑞清等,2010)。

1.3 菌株生理学特性的研究 1.3.1 温度对菌株生长的影响

无菌条件下,分别用直径10 mm的无菌打孔器切取PDA综合培养基上培养3天的供试菌株菌落,接种于PDA平板培养基中央,分别置于5,10,15,20,25,30,35 ℃ 7个温度下暗培养,每个处理设5个重复,3天后采用十字交叉法测量菌落直径。

1.3.2 光照条件对菌株生长的影响

无菌条件下,分别用直径10 mm的无菌打孔器切取PDA综合培养基上培养3天的供试菌株菌落,接种于PDA平板培养基中央,分别置于全黑暗、半黑暗半光照(12 h更替)和全光照的3种条件,每个处理设5个重复,置于25 ℃下培养,测量方法同1.3.1。

1.3.3 pH值对菌株生长的影响

用1 mol·L-1的NaOH和HCl溶液将PDA综合培养基的pH值分别调为4.0,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,8.0等7个梯度。无菌条件下,分别用直径10 mm的无菌打孔器切取PDA综合培养基上培养3天的供试菌株菌落,分别接种于各pH值平板培养基中央,每个处理设5个重复,置于25 ℃下暗培养,测量方法同1.3.1。

1.3.4 营养条件对菌株生长的影响

试验选择5种培养基:PDA综合培养基、MEA培养基、Czapek’s Agar培养基、PDA +落叶松韧皮培养基(配方为:落叶松韧皮木屑100g,加蒸馏水1 000 mL熬煮30 min后过滤,再加入PDA配方,pH自然)和落叶松韧皮+琼脂培养基(配方为:落叶松韧皮木屑100g,加蒸馏水1 000 mL熬煮30 min后过滤,再加入20g琼脂,pH自然)。无菌条件下,分别用直径10 mm的无菌打孔器切取PDA综合培养基上培养3天的供试菌株菌落,分别接种于5种平板培养基上,每个处理设5个重复,置于25 ℃下暗培养,测量方法同1.3.1。

1.3.5 碳源对菌株生长的影响

以Czapek’s Agar培养基为基础培养基,分别添加等量的葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、D -乳糖、可溶性淀粉10种碳源,以无碳作为对照。方法同1.3.4。

1.3.6 氮源对菌株生长的影响

以Czapek’s Agar培养基为基础培养基,分别添加等量的硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、酒石酸铵、甘氨酸、蛋白胨、酵母粉、谷氨酰胺、天门冬酰胺10种氮源,以无氮作为对照。方法同上。

1.4 数据分析

对所得数据均采用SPSS统计分析软件进行处理。

2 结果与分析 2.1 菌株分类地位的鉴定 2.1.1 菌株培养特性

CF1,CF2,CF3等3个菌株在PDA培养基上菌落致密,中央暗绿色绒毡状,边缘新生区域菌丝白色至淡绿色; 生长速度快,分别为2.45,2.34,2.51 cm·d-1 (图版I-13)。在MEA培养基上菌落致密,较厚,中央灰黑色绒毡状,边缘新生区域菌丝灰白色; 生长速度慢,分别为0.65,0.49,0.68 cm·d-1 (图版I-46)。

1-3.CF1,CF2,CF3在PDA培养基上的菌落特征;4-6.CF1,CF2,CF3在MEA人培养基上的菌落特征;7-10.CF1的子囊壳、孔口缘丝、子囊孢子、分生孢子梗及分生孢子;11-14. CF2的子囊壳、孔口缘丝、子囊孢子、分生孢子;15-18. CF3的子囊壳、孔口缘丝、子囊孢子、分生孢子。 1-3: Colony characteristics of 3 strains cultured on PDA medium; 4-6: Colony characteristics of 3 strains cultured on MEA medium; 7-10: Ascocarp, ostiolar hyphae, Ascospores, conidiogenous cells and Conidia of CF1; 11-14: Ascocaip, ostiolai hyphae, ascospores, conidia of CF2; 15-18: Ascocarp, ostiolar hyphae, ascospores, conidia of CF3.
2.1.2 放线菌酮耐性

3个菌株对放线菌酮反应极其敏感,0.05g·L-1的浓度能够完全抑制菌株生长。

2.1.3 菌株形态学

3个菌株在形态上基本一致,子囊壳表生,直径143 ~ 265 μm,基部球形,暗褐色至黑色,着生大量褐色菌丝,菌丝长度252 ~ 635 μm。颈部长485 ~ 1 105 μm,暗褐色至黑色,直立或稍弯曲,壁光滑,圆锥状,由颈基部向颈顶部渐细,基部宽32 ~ 60 μm,顶部宽11 ~ 23 μm,孔口缘丝透明,稍向外倾斜,长29 ~ 56 μm。子囊原囊壁渐消解,子囊孢子椭圆形,有胶质鞘,单细胞透明,(3.5 ~ 6) μm × (1.5 ~ 3) μm。分生孢子梗产生于营养菌丝上,多细胞,长133 ~ 305 μm,分生孢子圆筒形,单细胞透明,(9 ~ 16) μm × (4 ~ 7.5) μm (图版I-718)。

2.1.4 菌株rDNA ITS序列的测定

用引物ITS1和ITS4,对3个菌株rDNA的ITS区进行扩增,获得DNA的片段长度分别为542 bp (CF1),550 bp (CF2)和539 bp (CF3)。登录号分别为: HM776416,HQ707818和HQ707819。与GenBank核酸序列数据库中同源性较高的菌株进行比对,构建系统发育树(图 1)。结果表明,菌株CF2与菌株Ceratocystis fujiensis(AY233922)相似度为100%,菌株CF1和CF3相似度为100%。菌株CF2与菌株CF1和CF3在遗传距离0.002 134处出现差异,相似度高于99%。结合培养特性和形态学特征进一步证实3个菌株均为Ceratocystis fujiensis

图 1 长喙壳属内的rDNA-ITS基因序列的聚类分析 Figure 1 Phylogentic tree for rDNA-ITS gene analysis of Ceratocystis species

菌株间的遗传差异可能来自于地域、寄主以及寄主上的生长部位。

2.2 菌株生理学特性 2.2.1 温度对菌株生长的影响

3个菌株在5 ~ 30 ℃均能生长,温度达到35 ℃时停止生长(表 1)。温度30 ℃时菌落老化,新生菌丝灰暗; 温度低于15 ℃时,新生菌丝稀疏,菌落生长不旺盛。3个菌株的最佳生长温度均为25 ℃,此时菌落中央致密,新生菌丝白色幼嫩,生长旺盛。CF1和CF2在20 ~ 25 ℃生长较好,CF1在15 ℃和30 ℃时生长受到明显限制,CF2生长速度较CF1慢,但对高温耐受性较强。25 ℃下CF3生长最快,并且在20 ~ 30 ℃均生长良好,高温耐受性最强。

表 1 不同温度下3天各菌落生长直径 Tab.1 Colonial diameters at different temperature for 3 days
2.2.2 光照条件对菌株生长的影响

3个菌株在全黑暗条件下生长均最快,菌落也最新鲜(表 2)。CF1和CF3在半黑暗半光照和全光照下生长明显减退。CF2在3种条件下生长均较好,全黑暗和半黑暗半光照下生长无显著差异,说明该菌株对光照条件要求较宽泛。

表 2 不同光照条件下3天各菌落生长直径 Tab.2 Colonial diameters at different photoperiod for 3 days
2.2.3 pH值对菌株生长的影响

3个菌株在pH 4.0 ~ 8.0之间均能生长,pH 5.0生长最好(表 3)。CF1和CF2在pH 4.0,pH 5.0条件下生长无明显差异,CF1在pH 4.0 ~ 7.0之间菌落生长较好,适应pH较宽泛; CF2在pH 4.0 ~ 6.0之间菌落生长较好。CF3在pH 4.0和pH 5.5条件下生长无明显差异,在pH 4.0 ~ 6.5之间菌落生长均很好。pH 4.0 ~ 5.5时,3个菌株菌落呈绒毡状,致密,中央灰绿色,向外扩展为灰白至白色,新生区域宽,菌丝新鲜生长旺盛。pH越高,菌落越致密灰暗,新生区域越窄,菌丝老化速度也越快。

表 3 不同pH值下3天各菌落生长直径 Tab.3 Colonial diameters at different pH for 3 days
2.2.4 营养条件对菌株生长的影响

3个菌株均在PDA +落叶松韧皮培养基上生长最快,其次为PDA培养基(表 4)。说明落叶松韧皮部存在一些能够促进菌株生长的物质,这也可能是该菌较易定殖的原因,韧皮部浸提液与PDA培养基的营养结合最适合其生长。在这2种培养基上菌落生长致密,中央灰绿色绒毡状,新生区域宽,菌丝灰白新鲜。在其他3种培养基上生长则显著变慢,MEA培养基上生长最慢,菌落极其致密,呈较厚绒毡状; 落叶松韧皮+琼脂培养基上,菌落呈较稀疏绒毡状; Czapek’s Agar培养基上菌丝匍匐,菌落稀疏。

表 4 不同培养基培养3天各菌株生长直径 Tab.4 Colonial diameters at different medium for 3 days
2.2.5 碳源对菌株生长的影响

3个菌株在以蔗糖为碳源的培养基上生长最好,其次为可溶性淀粉(表 5)。CF1生长最快,CF3对可溶性淀粉和山梨醇的利用无明显差异,菌落在各碳源和无碳条件下生长均较稀疏。在以甘露醇、山梨醇、蔗糖、可溶性淀粉为碳源时,CF1和CF3生长速度较无碳条件快,说明这4种碳源可以利用,而其他6种碳源则抑制了二者生长; CF2在以葡萄糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、D-乳糖、可溶性淀粉为碳源时生长速度均快于无碳条件,说明这7种碳源该菌株都可以利用。

表 5 不同碳源下3天各菌落生长直径 Tab.5 Colonial diameters at different carbon source for 3 days
2.2.6 氮源对菌株生长的影响

CF1在硝酸钠为氮源时生长最快,其次为酵母粉和蛋白胨,二者无明显差异(表 6)。CF2和CF3的最适氮源均为蛋白胨,其次为酵母粉,CF3在3个菌株中生长最快。无氮条件下,3个菌株均有较快生长,但菌落极其稀疏,生长不旺盛。在以硝酸铵、酒石酸铵、蛋白胨、酵母粉、谷氨酰胺为氮源的条件下生长较好且状态相似,以酵母粉上生长最优,菌落初为白绿色绒毛状,中央渐呈灰绿致密,新生区菌丝白色,生长旺盛。其他氮源培养基上菌丝匍匐生长,菌落稀疏。

表 6 不同氮源下3天各菌落生长直径 Tab.6 Colonial diameters at different nitrogen source for 3 days
3 结论与讨论

对3个菌株的培养特性、放线菌酮耐性、形态学、分子生物学的研究表明,3个试验菌株的特征与Yamaoka & Marin报道的Ceratocystis fujiensis相符(Marin et al., 2005)。因此,将3个试验菌株确认为Ceratocystis fujiensis,为我国新记录种。目前,关于Ceratocystis fujiensis的报道主要集中于日本,研究表明,该菌为落叶松八齿小蠹的伴生真菌,在日本落叶松受到落叶松八齿小蠹入侵后,在边材中往往可以分离出C.fujiensis,其作为一种先导性入侵真菌,在受侵袭的原木边材中是主要的致病性真菌(Yamaoka et al., 1998; 2009; Chung et al., 2006)。小蠹虫伴生菌常作为先驱,杀死寄主树木活组织,使树脂合成和愈伤组织的产生受阻,从而有利于小蠹虫在寄主树木上的定居和发育(唐明等,1999)。另一方面,伴生菌分泌的一些物质,如异构戊醇可以提高小蠹虫聚集激素的活性(Birgersson et al., 1988)。关于Ceratocystis fujiensis对寄主树木的致病性、致病机制以及它与落叶松八齿小蠹的伴生关系将作为今后研究的重点。

本研究测定了Ceratocystis fujiensis 3个菌株的生物学生理学特性,获得其最佳生长条件:温度为25 ℃、全黑暗条件、pH 5.0、PDA +落叶松韧皮培养基、碳源为蔗糖、氮源为酵母粉。3个菌株均具有较强的高温和低温耐受性,这可能与其自然生存环境有关,更能够适应北方较大的温差,尤其是冬季可以在低温条件下保持休眠状态,条件适合时便在树体内迅速扩展。另外树体内的黑暗和酸性条件也比较适合3个菌株的生长。3个菌株对营养条件具有明显的选择性,落叶松树体内的营养容易被菌株利用。3个菌株可利用的碳源种类较多,以双糖(蔗糖)为最佳,单糖中的醇类(甘露醇、山梨醇)和多糖(可溶性淀粉)也较适合。氮源对菌落生长速度及疏密新鲜程度的影响较大,3株菌在有机氮源(酵母粉和蛋白胨)上生长状态最好。这些特性的深入系统研究有助于了解该菌对营养及环境条件的适应能力,对今后的研究具有重要意义。

参考文献(References)
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