古树是植物资源、风景资源、自然和文化遗产的重要组成部分, 具有独特的生态价值、观赏价值、历史文化价值和生命科学研究价值(徐炜, 2005)。但古树由于树龄高, 生理机能下降, 根部的吸收能力和再生能力减弱, 导致生长缓慢, 而生存环境的恶化, 使得古树均有不同程度的衰弱、衰老甚至死亡。北京市园林科研所调查资料显示:以北京市为例, 每年有0.3%的古树死亡, 处于濒危状态的古树占总体的l%左右、衰弱状态的约占5%。

古树的衰弱、衰老是整个树体形态、结构及生理机能都发生衰退的系统现象, 是树体自身遗传因素、环境因素和人为因素的综合结果。按照树势强弱(熊和平, 1999)、树龄(李东林等, 1998)等可以将古树划分为不同级别进行比较研究。研究衰老指标的报道有很多, 如叶片颜色、叶绿体结构(李锦龄, 1998)、叶绿素含量(何英姿等, 1997)、类胡萝卜素含量(徐德嘉, 1995)、光合速率、总蛋白、营养含量、抗氧化酶(杨淑慎等, 2001)、膜脂过氧化产物(Rajinder, 1981)、植物激素(何奇江等, 2005)、RNase活力等。调查古树的健康状况, 测定衰弱古树生理生化指标, 找出指示性指标, 明确导致其衰弱的主要因素, 有助于古树健康状况的诊断和评价, 是制定科学合理管护措施的基础。

油松(Pinus tabulaeformis)树姿苍劲古雅, 枝叶繁茂, 四季常青, 寿命可在千年以上, 常见于宫殿、庙宇。在华北地区的园林、风景区极为常见; 同时也是华北、西北地区主要的荒山造林树种, 具有重要的观赏、生态和经济价值。油松是北京颐和园的主要树种之一, 古油松是颐和园历史文化的重要组成部分。而近年来, 园内一些古油松出现了不同程度的衰弱。本研究以颐和园的不同树龄油松为对象, 探讨古油松衰老衰弱指标, 为评价古油松健康状况、制定相应的保护措施提供依据。

1 材料和方法

试验在2007—2009年进行, 于2008年和2009年进行系统取样。

1.1 供试材料

油松针叶采自北京颐和园。依据北京市质量技术监督局《古树名木评价标准》按照油松树龄, 将油松划分为＜20, 20~49, 50~99, 100~299(即二级古树)和≥300年(即一级古树)油松。在古树油松中, 与健康油松比较, 将具有树势弱, 树干大量空腐, 枝叶稀疏, 树冠不完整, 病虫害严重等特征的定义为衰弱油松, 进行对比取样。在衰弱油松中, 分别选择树龄100~299和≥300年的古油松(图 1)。在6月下旬油松针叶已基本长出后开始取样。6月下旬、7月下旬、9月上旬、10月上旬和12月上旬各取样1次。不同树龄健康油松、衰弱油松都分别选择代表性植株3株, 上午10点取树冠中部向阳部位的枝条上一年生的松针, 带回实验室, 取针叶中部测定各项生理指标。

1.2 测定指标与方法 1.2.1 针叶单位质量的长度测定

取一年生针叶用直尺测量总长, 天平称总重量, 计算总长度/总重量。从3株上取材, 每株取3份, 每份取10针, 共90针。

1.2.2 叶绿素含量测定

针叶剪碎用无水乙醇于暗处室温下浸提, 待组织变白后于波长649, 665 nm处测定提取液吸光度, 以无水乙醇为空白对照。总叶绿素、叶绿素a和叶绿素b含量的计算公式分别为:叶绿素a=13.70OD₆₆₅-5.76OD₆₄₉; 叶绿素b=25.80OD₆₄₉-7.60OD₆₆₅; 叶绿素a+b=6.10OD₆₆₅+20.04OD₆₄₉, 单位为mg·L^-1(李庆等, 2004)。

1.2.3 丙二醛(MDA)含量测定

采用张常青等(2005)方法, 取1 mL粗酶液和0.5 mL重蒸水加入到2.5 mL含有0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液, 混合, 沸水浴15 min后迅速冷却, 5 000 r·min^-1离心10 min, 上清液于波长532, 600 nm处测定吸光值。

1.2.4 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

取0.5 g针叶研磨样, 加入3 mL预冷的含0.1 mmol·L^-1EDTA、pH7.8的磷酸缓冲液混合后冰浴提取30 min, 12 000 r·min^-1低温离心15 min, 上清液即为粗酶液。取0.25 mL粗酶液用考马斯亮蓝(G-250)染色法测定可溶性蛋白含量。用NBT光化还原法测定SOD活性, 以抑制NBT光化还原50%为一个酶活性单位(张常青等, 2005)。

SOD比活力(U·mg^-1Pro)=SOD总活性(U·g^-1FW)/可溶性蛋白含量(mg·g^-1FW)。

2 结果与分析 2.1 不同树龄油松形态、针叶单位质量的长度

不同树龄和健康状况的油松, 树体形态不同。从图 1可知:健康油松树势强, 树干完整, 枝叶繁茂, 树冠完好, 一年生针叶粗壮, 无或少病虫害。其中＜20年油松(图 1-1)树高＜10 m, 树干胸径约0.1 m; 20~49年油松(图 1-2)树高约10 m, 树干胸径0.2~0.3 m; 50~99年油松(图 1-3)树高10~15 m, 树干胸径0.3~0.4 m; 100~299年油松(图 1-4)树高15~20 m, 树干胸径约0.4 m; ≥300年油松(图 1-6)树高＞16 m, 树干胸径约0.5 m; 衰弱古油松树势弱, 树干大量空腐, 枝叶稀疏, 树冠不完整, 一年生针叶量少, 短细而偏黄, 病虫害严重(图 1-5和图 1-7)。

油松完整针叶单位质量的长度体现了针叶的光合能力和贮存有机物的能力。从图 2可知:健康油松随树龄的增加, 针叶单位质量的长度在6, 7, 9月逐渐降低, 在10月和12月20~49年和50~99年的壮年油松远低于＜20年的低龄油松、100~299年和≥300年的古油松, 针叶粗壮, 有机物积累最多。衰弱油松针叶单位质量的长度均高于同树龄健康油松和其他树龄健康油松, 其中树龄100~299年衰弱油松比同树龄健康油松高12%~30%;树龄≥300年衰弱油松比同树龄高8%~24%;树龄100~299年衰弱油松高于树龄≥300年衰弱油松。健康与衰弱油松针叶的单位质量的长度都有一定季节变化。健康油松针叶单位质量的长度在夏季、秋季呈上升趋势, 在积累了同化物后, 针叶在冬季变粗壮, 针叶单位质量的长度下降; 而衰弱油松针叶单位质量的长度在夏、秋、冬3季都呈上升趋势, 积累能力弱。

由此可见:衰弱油松与健康油松比较, 树冠不完整, 一年生针叶柔弱细长, 针叶单位质量的长度值大, 与低龄油松类似, 衰弱油松针叶有机物质积累较少。与健康油松不同, 在一年的生长季节后, 衰弱油松针叶单位质量长度值在冬季仍然在升高, 主要是由于针叶干物质含量下降迅速, 针叶柔弱。

2.2 不同树龄油松针叶叶绿素含量与组成

叶绿素是植物光合作用的主要色素, 它的含量和组成决定叶片光合能力。叶绿素a和叶绿素b的比值反映植物对光能利用的效率。从图 3A可知:健康油松针叶叶绿素含量在10月和12月随树龄的增加而降低, 在6, 7, 9月随树龄的增加先升高到峰值后降低, 峰值分别为100~299, 50~99和20~49年油松。衰弱油松针叶叶绿素含量均低于同树龄健康油松和其他树龄健康油松, 其中树龄100~299年衰弱油松比同树龄健康油松低32%~52%;树龄≥300年衰弱油松比同树龄健康油松低36%~58%;树龄100~299年衰弱油松高于树龄≥300年衰弱油松。健康油松叶绿素含量在夏季逐渐升高, 在7或9月达到峰值, 在冬季降低。衰弱油松叶绿素含量在夏季逐渐升高, 秋季达到最大值, 冬季降低。叶绿素a和叶绿素b的变化趋势基本与总叶绿素相同(图 3B, C)。

健康油松针叶叶绿素a/b值随树龄的增加而降低, 衰弱油松略低于同树龄健康油松。健康油松针叶叶绿素a/b值在夏季到秋季基本呈降低趋势, 秋季到冬季在10月份升高后降低。衰弱油松针叶叶绿素a/b值的季节变化趋势基本与健康油松相同(图 3D)。

由此可见:油松针叶叶绿素含量在生长季节开始随时间延长而升高, 在7—9月达到峰值后, 秋冬季节下降; 叶绿素a和b含量的季节变化规律类似。与健康油松相比, 衰弱油松叶绿素含量低、光合能力弱; 同时, 衰弱油松针叶绿素a/b值也低于健康油松。在健康油松中, 叶绿素a/b的值随树龄的增大而降低。

2.3 不同树龄油松MDA含量

植物叶片MDA含量是细胞质膜脂过氧化程度的指标。健康油松针叶MDA含量随树龄的增加而升高。衰弱油松针叶MDA含量高于同树龄正常油松和其他树龄健康油松, 其中树龄100~299年衰弱油松比同树龄健康油松高15%~61%;树龄≥300年衰弱油松比同树龄健康油松高14%~59%;树龄≥300年衰弱油松高于树龄100~299年衰弱油松。健康油松和衰弱油松针叶MDA含量在夏、秋、冬3季都基本呈上升趋势, 健康油松12月比6月平均高77%, 衰弱油松平均高20%, 但7月MDA含量略高于9月(图 4)。由此可见:在一年的生长季节中, 油松MDA含量基本随针叶的发育逐渐升高, 叶细胞的膜脂过氧化程度不断加深。与健康油松比较, 衰弱油松针叶MDA含量远高于健康油松。

2.4 不同树龄油松SOD活性

SOD是清除自由基和活性氧的重要防御系统保护酶之一。健康油松针叶SOD总活性和比活力都随树龄的增加呈降低趋势。衰弱油松针叶SOD总活性最低, 其中100~299年衰弱油松比同树龄健康油松低6%~21%;树龄≥300年衰弱油松比同树龄健康油松低10%~20%。健康油松和衰弱油松针叶SOD总活性从夏季到冬季都基本呈降低趋势。健康油松12月比6月平均低23%;衰弱油松平均低18%(图 5A)。衰弱油松针叶SOD比活力最低, 其中100~299年衰弱油松比同树龄健康油松低7%~14%;≥300年衰弱油松比同树龄健康油松低5%~12%。健康油松和衰弱油松针叶SOD比活力从夏季到秋季基本呈上升趋势, 在9月达到峰值, 之后下降(图 5B)。由此可见:油松针叶SOD总活性随针叶的发育和树龄的增加而逐渐降低, 但SOD比活力在生长旺盛的9月较高。衰弱油松针叶SOD总活性和SOD比活力在夏、秋、冬3季均低于健康油松。

综上所述, 在形态上健康油松树势强, 树冠完好, 一年生针叶粗壮; 而衰弱油松树冠不完整, 一年生针叶柔弱细长, 针叶单位质量的长度值大。与健康油松相比, 衰弱油松叶绿素含量低、光合能力弱, 叶绿素a/b值低, 光能利用效率低。在一年的生长季节中, 油松MDA含量随针叶的发育逐渐升高; 与健康油松比较, 衰弱油松针叶MDA含量远高于健康油松, 针叶SOD总活性和SOD比活力在夏、秋、冬3季均低于健康油松, 其抗氧化能力弱。

3 讨论 3.1 关于园林古树的分级评价方法

在园林古树研究中, 确切地对研究对象进行分级是前提, 其分级标准也很多。北京市《古树名木评价标准》根据树龄将古树分级为:树龄在300年(含300年)以上为一级古树; 树龄在100年(含100年)以上300年以下为二级古树。李东林等(1998)将黄山松划分为20, 40, 60, 80, 100, 150年6个龄阶; 何英姿等(1994)在研究白皮松(Pinus bungeana)时, 按树龄100~300年、300年以上和树势壮弱分别取材进行比较。在古树调查研究中, 还可以按树势强弱分4个级别进行评价:树势良好株为Ⅰ级; 树势基本正常株为Ⅱ级; 树势衰弱株为Ⅲ级; 垂死株为Ⅳ级(熊和平, 1999)。而高鹏等(2006)在调查中将古树分为5级:旺盛、一般、较差、濒死、死亡。本研究综合借鉴以上分类方法, 为了便于研究, 将油松按树龄分为:＜20年, 20~49年, 50~99年, 100~299年和≥300年; 按树势强弱、树干、枝叶、树冠、一年生针叶数量和形状、病虫害情况等分为健康油松和衰弱油松。这样划分兼顾古树定义中树龄的差别及油松树势、形态等的差异, 较为科学、合理、可行。

3.2 关于古树衰弱的诊断指标

古树衰弱的诊断指标研究报道较多, 如叶片结构、叶绿素和蛋白质含量、活性氧清除系统、矿质营养元素、内源激素等(张艳洁等, 2010)。本研究中, 笔者主要测定了油松针叶单位质量的长度、针叶叶绿素含量、MDA含量和SOD活性等。

3.2.1 形态指标

黄山松(Pinus taiwanensis)100年后针叶长度变短, 叶色变淡细软(李东林等, 1998)。油松针叶的单根长度和质量的变化与植株生长势有很大关系(温秀军等, 1990)。本研究结果表明:衰弱古油松树势弱于同树龄正常油松, 其枝叶稀疏, 树冠不完整, 一年生针叶量少、短细而偏黄。衰弱古油松的针叶单位质量的长度显著高于同树龄油松, 说明其针叶光合作用合成和积累有机物的能力低于健康油松, 即衰弱油松同化作用减弱, 异化作用增强。本研究的油松树势、树冠完整度、针叶叶色、长度、单位质量的长度均可用于初步诊断油松的衰弱程度, 其中枝叶稀疏、树冠不完整、一年生针叶量少、短细而偏黄等可指示为衰弱油松。

3.2.2 叶片光合能力

叶绿素含量和衰老存在明显的负相关, 叶绿素降解可能是衰老的标志之一(马林, 2007)。在衰老过程中, 叶绿素的组成也发生变化, 其中叶绿素a含量下降更快, 改变了叶绿素a/b的比值。Woolhouse等(1984)认为叶绿素a/b的下降促进了衰老过程。戒台寺和潭拓寺中健壮的古油松比衰弱植株叶绿素含量高约30% (李庆等, 2004)。古白皮松壮树叶片叶绿素含量明显高于弱树和特弱树, 特弱树叶绿素含量只有壮树的50% (何英姿等, 1997)。在本研究中, 衰弱油松叶绿素含量少, 吸收光能能力差, 光和效率低, 光和产物少, 因此针叶单位质量的长度较大。衰弱油松叶绿素a/b值低于健康油松, 且叶绿素a/b值随树龄的增大而降低, 这与前人研究叶绿素a/b下降促进衰老一致。

3.2.3 膜脂过氧化及抗氧化酶系统

在植物衰弱衰老过程中, 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化氢酶(APX)等抗氧化酶类活性降低, 自由基和活性氧产生和清除的平衡被打破, 导致膜脂过氧化、膜的完整性受到破坏(马林, 2007)。20~60年黄山松针叶中SOD活性变化不大, 80年后开始下降; CAT活性在80年后黄山松中急剧下降(李东林等, 1999); SOD活性在衰弱的古白皮松中活性降低, 针叶MDA含量升高(何英姿, 1994)。而APX活性在银杏(Ginkgo biloba)叶片衰老过程中先升高后下降(魏晓东等, 2008)。从本研究结果可知:油松一年生针叶MDA含量从夏季到冬季逐渐升高。随着针叶的发育过程, 叶细胞的膜脂破坏程度不断加深, 因而针叶中积累的MDA含量逐渐升高。衰弱油松的SOD总活性和SOD比活力均低于同树龄健康油松; ＜20年健康油松的SOD总活性保持在较高水平, 随树龄的增加SOD酶活性降低, 同时伴随着MDA含量的增加。其中, 7月份SOD活性比6月略有降低, MDA含量略有升高, 可能是因为北京7月高温、降雨导致的。综上所述, 在油松逐渐成熟进入古树期时, 抗氧化酶活性降低, 自由基产生和清除平衡被打破, 导致膜脂过氧化, 进而引起叶绿体超微结构的损伤、叶绿素降解和光合酶活性下降等。

与健康树木比较, 古树在衰弱、衰老过程中, 会在植株形态、组织、细胞、分子等不同水平上发生一系列的变化。因此, 反映古树衰弱、衰老的诊断指标具有多样性。本文主要调查了古油松针叶形态、光合能力、抗氧化酶等方面的部分指标, 对古油松衰老衰弱诊断方法进行了初步研究。在古树衰老衰弱诊断指标研究中, 还有待进一步从光合酶类、逆境代谢产物、渗透胁迫物质、植物激素和衰老基因表达方面进行更深入的研究。