黄栌(Cotinus coggygria)为漆树科(Anacardiaceae)黄栌属(Cotinus)落叶灌木或小乔木, 是香山红叶景观的主体树种, 共有10万余株, 主要分布在海拔150~500 m的东南部阴坡和半阴坡。

目前国内外关于黄栌叶色及色素组成方面的报道较少, 郝峰鸽等(2007)测定了5月份黄栌绿色叶片中各类色素含量的变化, 但未涉及黄栌叶在由绿变红过程中色素的变化。周肖红等(2009)调查了黄栌秋季变色期叶片内的花青素含量的变化, 但未报道其他类黄酮色素、叶绿素、类胡萝卜素等主要呈色色素的动态变化, 而叶色的呈现是这几种色素共同作用的结果。本研究选取香山不同海拔处的黄栌, 采集叶片分析其中所含有的花青素苷、类黄酮、叶绿素、类胡萝卜素等色素成分的组成及其含量的变化, 建立叶色和色素组成之间的对应关系, 揭示黄栌叶色形成的化学机制。此外, 调查了从9月下旬至11月上旬香山黄栌叶色变化, 归纳海拔195~564 m范围内的叶色垂直分布规律, 为香山公园开展叶色预报、科普宣传、导游服务奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

在香山海拔195, 315, 466和564 m处, 各建立1块长15 m、宽5 m的长方形样地, 4块样地均为纯黄栌林, 半阳坡(东向), 黄棕壤土。每块样地确定采样树5株, 在取材时选取树龄, 长势等基本一致的样树。2007年9月下旬到11月上旬, 每隔4天采样1次。随机摘取每株样树中部外层南向枝条的成熟叶片15片, 放入自封袋中单独保存。采回叶片进行叶色测定后, 立即液氮研磨, 置于-40 ℃冰箱保存。

1.2 试验方法 1.2.1 叶色测定

利用国际照明委员会(International Commission on Illumination, CIE)表色系实现叶色的数字化测定。取采回的新鲜叶片, 用分光色差仪(NF333 spectrophotometer, 日本电色工业株式会社)在C/2°光源下进行叶色测量, 5次重复。通过测定明度L^*值、色相a^*值、b^*值, 计算出彩度C^*值, 公式如下:C^* =(a^*2+b^*2)^1/2。在CIEL^*a^*b^*表色系统中当L^*值从0升至100时, 明度逐渐增加; 而反映绿、红属性的色相a^*值由小变大, 表示绿色减退、红色增强; 同样反映蓝、黄属性的色相b^*值增加时, 意味着蓝色逐渐消退, 黄色增强; C^*值表示到L^*轴的垂直距离, 距离越大, 彩度越大(Wang et al., 2004)。

1.2.2 类黄酮色素的定量分析

1) 提取方法  称取1.0 mg液氮保存的新鲜叶片的粉末, 加入组成为甲醇︰水︰甲酸︰三氟乙酸(70︰27︰2︰1, V/V)提取液5 mL, 置于4 ℃冰箱中避光浸提24 h, 每隔12 h振荡1次。抽提上清液先用直径9 mm的中速滤纸粗滤, 再经微孔滤膜(0.45 μm)过滤, 供花青素苷和黄酮醇苷的定量分析用。

2) 定量分析  利用高效液相色谱—二极管阵列检测器联用(HPLC-DAD, Dionex公司)进行花青素苷和黄酮醇苷的定量分析。

分析条件:柱温35 ℃, 流速0.8 mL·min^-1, 进样体积10 μL, 花青素苷和黄酮醇苷的检测波长分别为517和350 nm。流动相A液为乙腈︰甲醇(85︰15, V/V); B液为甲酸︰水(10︰90, V/V)(Buchert et al., 2005)。线性梯度洗脱, 程序如下:0 min, 88%B液; 20 min, 82%B液; 30 min, 80%B液; 40 min, 70%B液; 45 min, 88%B液。利用Chameleon软件分析试验结果。

定量方法:分别在最大吸收波长517和350 nm同时检测总花青素苷(total anthocyanins, TA)和总黄酮醇苷(total flavonols, TF)含量。采用标准品外标法作标准曲线定量。标准品为矢车菊素3-O-半乳糖苷(Cy3Gal)和芦丁(rutin), 用其分别确定TA和TF的外标曲线。将其分别溶于0.1%的盐酸-甲醇和甲醇中, 精密配制Cy3Gal的5个不同浓度, 范围为22.50~360.00 μg·mL^-1, 精密配制rutin的8个不同浓度, 范围为9.17~917.00 μg·mL^-1, 每个浓度的标准品均进行3次重复, 各进样10 μL。以UV-vis光谱下吸收峰面积为纵坐标, 以进样浓度(μg·mL^-1)为横坐标制作标准曲线, 再根据曲线计算每克新鲜叶片中含有的相对于标准品Cy3Gal和rutin的TA和TF含量(mg·g^-1 FM)。

1.2.3 叶绿素和类胡萝卜素的定量分析

1) 提取方法  称取0.2 g液氮保存的新鲜叶粉末, 加入5 mL 80%丙酮, 置于4 ℃冰箱中避光浸提24 h(Cox et al., 2004), 取上清液用直径9 mm的中速滤纸过滤后, 供分析用。

2) 定量分析  参照Lichtenthaler(1983), 利用UV-vis双光束分光光度计(UV-4802, UNICO公司)进行叶绿素和类胡萝卜素的定量分析。

1.3 数据分析

数据使用SPSS 11.5软件进行回归分析和方差分析, 不同海拔间叶色参数和色素组成的差异性采用S-N-K多重比较进行检验(P < 0.05), 作图采用Origin 8.0软件, 图中标准误来自于样本的5个重复。

2 结果与分析 2.1 黄栌叶片色素组成和叶色的关系

以叶色参数L^*, a^*, b^*和C^*作为因变量, 叶片中花青素苷(TA)、黄酮醇苷(TF)、叶绿素(TCH)和类胡萝卜素(TCA)的含量作为自变量, 进行多元逐步线性回归分析(Multiple Liner Regrssion, MLR-Stepwise), 变量引入的显著水平设置为0.05, 探讨黄栌叶片中色素组成与叶色之间的关系。统计结果如下(共175个样本):

L^* =34.096+0.953TF-3.334TCH-2.375TA (R=0.422),

a^* =9.634-23.680TCH+9.599TA (R=0.845),

b^*=15.040+1.113TF-5.509TCH-3.708TA (R=0.439),

C^*=19.767-6.309TCH+0.918TF (R=0.387)。

回归分析表明:黄栌叶片中的叶绿素、花青素苷和黄酮醇苷与黄栌的叶色形成密切相关, 其中花青素苷含量与a^*成正相关, 与b^*, L^*成负相关, 即花青素苷含量的增加, 将使得叶片的红色调增加, 同时黄色调和明度降低; 叶绿素含量与a^*, b^*, C^*, L^*均成负相关, 即叶绿素含量的增加, 将使得叶片的红、黄色调以及整体的彩度和明度降低; 黄酮醇苷含量与b^*, C^*, L^*成正相关, 即黄酮醇苷含量的增加, 将使得叶色的黄色调、彩度及明度增加; 类胡萝卜素含量未被引入各回归方程, 即其与叶色各参数均无显著相关性(P＞0.05), 表明类胡萝卜素含量对叶色的变化没有贡献; 在4个方程中, 叶绿素含量系数的绝对值最大, 说明叶绿素含量对各叶色参数的影响最显著, 降低叶绿素的含量, 增加花青素苷的含量可以使叶片变红, 而要使叶色变得更加艳丽, 在降低叶绿素含量的同时, 需要增加黄酮醇苷的含量。

2.2 单株黄栌叶色和色素组成的变化 2.2.1 叶色变化规律

黄栌在秋季叶色逐渐由绿色转为红色, 以一单株为例, 说明叶色变化过程中, 叶色明度L^*值、色相a^*值和b^*值、彩度C^*值以及叶片中花青素苷、黄酮醇苷、叶绿素和类胡萝卜素等色素的变化规律。

黄栌叶色变化如图 1所示:在这一过程中, 色相a^*值逐渐增大, 至10月24日达到最大值, 随后缓慢下降, 至11月5日迅速下降; 色相b^*值缓慢上升, 至11月5日后迅速上升; C^*值变化趋势与色相b^*值变化趋势基本相同; 明度L^*值在11月5日前较稳定, 其后迅速上升(图 1)。叶色由绿转红过程中色相a^*值的变化最大, 而在CIEL^*a^*b^*表色系统中, a^*值由小变大, 意味着绿色减退、红色增强, 因此, 可以用色相a^*值作为叶色的代表性参数来描述黄栌叶色的变化。

2.2.2 色素组成的变化规律

在黄栌叶色由绿转红过程中, 叶片内的叶绿素含量迅速下降, 10月4日—10月20日每4天的含量变化都具有显著性差异(P＜0.05), 至10月24日含量降到很低(＜0.5 mg·g^-1), 几乎完全降解; 花青素苷含量缓慢上升, 至10月28日后急速增加, 11月1日达到最高值, 随后下降; 类胡萝卜素含量变化相对比较稳定, 前期含量较高, 10月12日至11月5日变色期内含量无显著差异(P＞0.05), 11月5日后有所上升; 黄酮醇苷呈现一直上升的趋势, 且含量高于其他3类色素(图 2), 在1.08~6.25 mg·g^-1FW间, 而叶绿素、花青素及类胡萝卜素的含量范围分别为(0~0.53), (0.01~0.90), (0.07~0.28) mg·g^-1FW。

2.3 香山不同海拔高度黄栌叶色和色素组成的时空变化

不同海拔处样树在10月8日前叶色均为绿色, 无显著差异; 10月8日后, 叶色开始变红, 色相a^*值上升, 高海拔564 m处的样树色相a^*值上升较慢, 低于其他3块样地, 具有显著差异(P＜0.05);但至10月16日后色相a^*值迅速增加; 20日已达到其他3块样地的叶色水平, 叶色呈现红色, 到10月24日达最大值, 随后迅速下降。中海拔466和315 m处变色规律一致, 色相a^*值在10月28日达最大值, 466 m处的色相a^*值高于315 m处, 但没有显著差异, 随后有所下降。而低海拔195 m处与其他3块样地变化趋势不同, 色相a^*值呈现一直上升的趋势(图 3), 在10月20日前, 与中海拔样地的色相a^*值无显著差异, 但10月20日后上升较缓慢, 与其他3块样地出现显著差异(P＜0.05), 直至11月1日才达到与其他样地一致的红色效果。各海拔处的黄栌叶中花青素苷含量的变化趋势与其相应的色相a^*值的变化基本一致, 但最高峰出现时间要晚于色相a^*值(图 4), 高海拔处最大花青苷含量出现在10月28日, 中海拔处出现在11月1日。各海拔处黄栌叶片中叶绿素含量变化趋势基本相同, 前期迅速下降, 至10月24日, 几乎完全降解。(图 5)。

3 结论与讨论 3.1 黄栌叶色形成的化学机制

植物花瓣和叶片的颜色, 与其含有的色素种类、色素含量、植物器官内部或表面构造、液泡内pH值等多种因素有关, 但是其中色素种类和含量的影响最大。彩叶植物呈现彩色的直接原因就是叶片中的色素种类和含量发生变化(安田齐, 1989; 戴思兰, 2004)。叶色形成的化学机制探讨的是叶色形成的物质基础以及叶色与叶片色素组成二者之间的关系, 将叶色用CLEL^*a^*b^*变色系统数字化后, 通过逐步回归建立起叶色与色素组成的关系, 研究色素组成对叶色的影响。

许多温带落叶树种的叶片在秋季呈现明亮的红色或黄色, 红色多是由于新合成的花青素苷在叶片内的积累, 黄色则一般是叶绿素降解后原有的类胡萝卜素显现出本来的颜色(Collier et al., 1995; Matile, 2000; Feild et al., 2001)。秋季黄栌红色叶片中含有花青素苷、黄酮醇苷、叶绿素和类胡萝卜素4大类色素。多元线性回归分析结果表明:反应绿、红属性的色相a^*值与叶绿素含量成负相关, 与花青素苷含量成正相关, 即叶色变化过程中, 叶绿素含量的下降, 花青素苷含量的增加, 是黄栌叶片绿色褪去、红色显现的主要原因, 且花青素苷大量合成的时间在叶绿素分解之前; 在叶色变化过程中, 黄酮醇苷含量有上升的趋势, 与b^*, C^*, L^*成正相关, 增加叶片的艳丽程度; 类胡萝卜素的含量比较稳定, 未被引入各回归方程, 即其与叶色各参数均无显著相关性, 对黄栌的叶色变化不产生显著影响。

3.2 香山黄栌叶色的时空分布规律

通过2007年秋季的调查可知:香山从195~564 m范围内不同海拔高度处黄栌叶色的时空分布规律。时间尺度上, 以高海拔564 m处样地为例, 从10月12日始, 黄栌单片叶边缘或沿叶脉已开始变红, 此时已经能从叶片中检测到花青素苷的存在, 但色相a^*值还为负值, 整体树的红色效果还不容易被观测到, 至10月20日色相a^*值已大于10, 此时已能看到整体树变红, 至10月28日色相a^*值达最大值, 呈现最佳观赏效果, 随后a^*值逐渐下降。空间尺度上, 高海拔564 m处的黄栌变色较早, 叶片变红后, 由于山顶风大、湿度小, 落叶也快, 适合前期观赏(10月20日至10月28日); 中海拔466和315 m处黄栌与高海拔处变色期基本一致, 红叶期持续时间久, 观赏期长(10月24日至11月5日); 低海拔195 m处黄栌最晚变色, 落叶期也晚, 适合后期观赏(11月1日以后)。各海拔处黄栌叶片的花青素苷含量变化和相应的色相a^*值的变化趋势基本一致, 564, 466和315 m处黄栌呈现先上升后下降的趋势, 195 m呈现一直上升的趋势, 而4块样地的叶绿素均出现急剧下降的趋势。香山最高峰564 m, 高、低海拔叶色差异明显, 于晓南(2000)发现位于山顶光照充足的黄栌叶片鲜艳美丽, 而位于山底光照不充足的植株, 叶片掺杂了不同程度的绿色, 观赏效果不佳。本研究将香山垂直高度细化为4个海拔范围, 通过2007年秋季从10月下旬到11月上旬的调查, 得到黄栌从195~564 m的叶色和色素组成分布规律, 发现中海拔地区是黄栌的最佳观赏区, 高、低海拔地区是观赏期的延伸和补充。基于上述详细的数据和一系列图示, 能够进行叶色的预测预报, 如叶片开始变色的大致时间、叶色变色的规律及不同海拔处的变色顺序, 这些结果能更好地为香山公园管理者、旅游部门和旅游者服务。

3.3 叶色数字化方法的推广

彩叶植物是近年来观赏树木的研究热点之一, 广泛应用于园林造景实践之中, 其叶色的变化直接影响园林景观效果, 是决定园林环境优美程度的重要因素之一。长期以来, 多以个人的经验来评价叶色指标, 本研究利用国际上通用的分光色差仪来测定黄栌的叶色并定量评估其变化幅度, 研究发现黄栌叶片在色相a^*值大于10后, 才具备较好的观赏效果, 而在此之前, 从叶片中虽然可以检测出花青素苷的存在, 但叶绿素含量过高, 掩盖了花青素苷的显色效果, 色相a^*值此时还是负值, 叶片并不具备红叶观赏性。分光色差仪测定法可以推广到其他彩叶植物的研究中, 成为叶色研究重要手段, 使得不同的研究者对不同植物、不同季节之间的叶色研究结果具有可比性, 并可将叶色参数和色素组成的关系建立起来, 有助于科学地解析彩叶植物的叶色形成的化学机制。