由于松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和拟松材线虫(B.mucronatus)亲缘关系极为相近，是否能进行种间杂交并出现杂交后代的问题很早就引起了人们的重视。在死亡的松树里经常见到松材线虫和拟松材线虫，它们时而混生，时而单独出现。目前松材线虫和拟松材线虫已被公认为2个不同的种(杨宝君，1985;沈伯葵等，1993)。二者在致病性和分布上均有明显差异，松材线虫具有极强的致病性，无论在野外还是人工接种条件下都能引起松树迅速萎蔫。而分布较广的拟松材线虫对松树通常不致病或致病力极低，绝大多数拟松材线虫只出现于由其他因素引起的枯死株或濒死株中(Mamiya et al., 1979; Futai，1980;程瑚瑞等，1986;杨宝君，1995;胡凯基等，1994)。

不少学者对松材线虫与拟松材线虫种间杂交及种下水平的交配潜力及其后代的致病性、宿主特异性等方面已经进行了研究。Braasch(1994)，Hajaukiewicz等(1988)报道一株西伯利亚拟松材线虫与一种北美有尾尖突型松材线虫株系、德国拟松材线虫株系与日本松材线虫株系、日本松材线虫株系与法国拟松材线虫株系具有很高的杂交潜力，杂交后代数量大，其中德国拟松材线虫株系与日本松材线虫株系杂交能产生有致病能力的后代(秦复牛等，2003); Mamiya等(1979)通过杂交F1不育; Riga等(1992)以及Bolla等(1993)通过部分松材线虫与拟松材线虫杂交F1代可育; 刘伟等(1994)用中国不同株系的松材线虫和拟松材线虫与其他国家的松材线虫和拟松材线虫进行种间杂交试验，结果表明种间杂交多数后代雌虫较难与父本回交产生子代幼虫。他们认为松材线虫和拟松材线虫虽然在人工试验条件下能杂交成功，但由于种间杂交后代数量少且不能连续下去，所以认为在自然条件下中国的松材线虫不会通过与拟松材线虫的杂交而导致疫区扩大。季宏铁(2004)报道来源于欧洲的部分拟松材线虫群体可以与来源于北美洲的某些松材线虫群体产生可育的杂交后代。

以上研究表明，不同来源的松材线虫和拟松材线虫虫株之间的杂交可能出现不同的结果。有的不能产生后代，有的能够产生后代，有的产生畸形后代等。所以松材线虫和拟松材线虫种间杂交还需要进一步考证，对解释近年来出现的拟松材线虫成片致病，松材线虫和拟松材线虫虫株在形态上出现交叉等不明现象有重要的帮助(方光明，1996;姚晓华，1996;刘伟等，1995)。本文用来自中国江苏宜兴的拟松材线虫虫株和中国、美国、日本、韩国的松材线虫虫株进行杂交，研究二者之间的交配能力，杂交后代的生存能力以及杂交后代的致病性。以明确在自然界松材线虫是否会通过与拟松材线虫杂交，这对松材线虫病流行规律研究及病害的防治有着重要的意义。

1 材料与方法 1.1 供试线虫

供试线虫为:松材线虫(无尾尖突型)(简称Bx)5个株系，株系号及来源如下: 1)Ch-Bx1，从南京溧水采集感病马尾松(Pinus massoniana)，将采回的木段劈成小木片后分离松材线虫; 2)Ch-Bx2，从浙江省采集感病马尾松，将采回的木段劈成小木片后分离松材线虫; 3)J-Bx1，从日本伍太先生提供的感病木材中分离获得; 4)A-Bx，从美国进口包装材中分离获得(江苏出入境检验检疫局提供); 5)H-Bx，从韩国进口的包装材中分离获得(江苏出入境检验检疫局提供)。拟松材线虫(有尾尖突型)(简称Bm)一个株系: Ch-Bm，从江苏省宜兴市感病马尾松分离获得。

所有线虫均用贝尔曼漏斗法进行分离(Baujard，1980)，并由本实验室显微镜鉴定后，挑取30条雌、雄成虫放在长满灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的PSA平板上，25 ℃恒温箱中黑暗培养备用。

1.2 未交配雌线虫的获得

为确保种间交配而非种内交配，首先要获得线虫的“未交配雌线虫”。为此进行了以下探索:

1) 真菌培养:在直径5 cm小培养皿中加入PSA培养基，再接入灰葡萄孢菌丝，待灰葡萄孢菌丝长满培养皿时挑入1条大龄幼虫，培养3天后镜检观察成虫性别。

2) 少量真菌培养:在小培养皿中倒入含1/10 PSA的培养基，接入灰葡萄孢菌丝，待灰葡萄孢菌丝生长36 h，大约长到培养皿1/5大小时挑入1条大龄幼虫培养。

3) PSA培养:在小培养皿中倒入含PSA的培养基，不接灰葡萄孢，直接挑入1条大龄幼虫培养。

4) 抗菌素抑制培养:在小培养皿的PSA中加入青霉素(100万单位·mL^-1)(以杀死线虫体表细菌)，挑入1条大龄幼虫，培养。

5) 大豆蛋白培养:在小培养皿中倒入含大豆蛋白胨的固体培养基(Mamiya et al., 1972)，挑入一条大龄幼虫培养。

6) 生理盐水培养:在装有生理盐水的小培养皿中，挑入1条大龄幼虫培养。

7) 液体培养基培养:在小培养皿中倒入1/10马铃薯液体培养基，调节至pH 4.5~5.0(以抑制细菌生长)，向小培养皿中挑入1条大龄幼虫培养。

8) 无菌水培养:在小培养皿中倒入无菌水，挑入1条大龄幼虫培养。

9) 无菌水加菌丝培养:选注射用的小青霉素瓶，每瓶加入2 mL无菌蒸馏水，挑入1~2根灰葡萄孢菌丝，再挑入1条大龄幼虫培养。

1.3 杂交方法 1.3.1 松材线虫和拟松材线虫的杂交方法

在试管中长满灰葡萄孢的PSA斜面上接种已培养好的单条未交配雌成虫和3条异种雄成虫，同时作反交组合，每个组合重复20次。25 ℃恒温箱中黑暗培养10天后，用无菌水洗出各试管中线虫，镜检杂交后代。

1.3.2 杂交后代的继代能力测定

为测定杂交后代的继代能力，在试管中长满灰葡萄孢的PSA斜面上放入杂交试验后产生的杂交后代幼虫30条，重复3次。放入幼虫后，25 ℃恒温箱中黑暗培养10天，用无菌水洗出各试管中线虫，镜检繁殖后代，计数后代线虫数量和成虫雌雄比例。

1.3.3 杂交后代的形态观察

采用热杀死法杀死线虫:用无菌水洗出线虫，将杂交与继代培养的线虫悬浮液转入离心管中，离心管放在65 ℃水浴锅中1 min杀死线虫，立即向线虫悬浮液中加入等量浓缩2倍的FA固定液(福尔马林:冰醋酸=4:1)。将固定后的杂交与繁殖后代线虫群体在显微镜下观察，记录线虫形态及成虫的雌雄比等。

1.4 杂交后代线虫的接种测定

接种采用皮接法:用无菌解剖刀片在2年生马尾松苗茎中部的一侧切开长约0.5 cm的伤口，伤口深达木质部，在伤口处夹入一小团无菌脱脂棉球，用封口膜将马尾松苗与脱脂棉包扎起来，封口膜外再用透明胶带包成一个小漏斗，将所有杂交组合后代线虫悬浮液0.5 mL滴入脱脂棉，线虫接种量约为3 000条·mL^-1，每个杂交组合接种5株，同时以蒸馏水为对照。在接种后的24 h内每隔3 h给脱脂棉滴加适量蒸馏水保湿。接种后，室内温度保持25~30 ℃，观察马尾松苗的变化，当松苗嫩梢开始萎蔫，针叶全部变黄时，将马尾松苗从土中拔出，洗净根部后将整株剪碎，用无菌水浸泡洗出线虫，离心收集线虫，显微镜检查线虫分离情况，计数分离线虫数量。

2 结果与分析 2.1 未交配雌成虫培养方法研究

通过9种方法培养大龄幼虫，在25 ℃恒温箱黑暗培养3天后，寻找线虫并在显微镜下观察，确定线虫的性别供交配使用。9种方法对于线虫的生长和观察的难易程度各有不同(表 1)。前8种方法都存在一定缺陷，用灰葡萄孢培养不易找到线虫; 用培养基直接培养容易被细菌覆盖; 用生理盐水或无菌水培养线虫不生长或死亡。只有无菌水加灰葡萄孢菌丝培养，既能供给线虫营养，又不利于细菌生长繁殖，还能容易地找到线虫，是一个较好的方法。

2.2 松材线虫和拟松材线虫杂交结果

松材线虫与拟松材线虫杂交，经10天培养后分离观察，记录杂交的后代数量，后代的存活情况及成虫的雌雄比，结果见表 2。结果表明各株系的松材线虫与拟松材线虫可以杂交且杂交率均较高，由此可初步判断2个异种线虫之间可以进行杂交。Ch-Bm与Ch-Bx1的杂交组合正交(雌虫为拟松材线虫)杂交率达到93.8%，反交(雌虫为松材线虫)率比正交杂交率小，正交的子代中，雌成虫比例是雄虫比例的10倍多，而反交中雄虫比例是雌虫比例的近2倍。Ch-Bm与Ch-Bx2的杂交组合正交率高于反交率，正反交后代雌虫数都明显高于雄虫，成虫比例相近。Ch-Bm与J-Bx1的杂交组合中，正反交率最相近，说明拟松材线虫和日本松材线虫杂交，无论谁做母本，其产生后代的能力都相似。Ch-Bm和A-Bx的组合正反交都有较高的杂交率，但是正交中成虫比例大于50%，这是所有杂交组合中唯一的成虫比例大于幼虫的一组，有可能是因为这个杂交组合产生的后代幼虫发育的比较快，反交的成虫比例仅在20%左右，雌虫比例是雄虫比例的近6倍。Ch-Bm和H-Bx的杂交组合中，镜检时发现很多线虫已经死亡。反交杂交率明显小于正交，且10天镜检时没有发现成虫，但继续培养30天后出现成虫，说明这一组合的杂交后代幼虫发育迟缓，杂交后代可育性低。

2.3 杂交后代的繁殖情况

线虫杂交后代在25 ℃恒温箱中黑暗培养10天后，镜检繁殖后代的线虫数量，结果发现试管中的线虫数量远远大于原有线虫数量(表 3)。从表 3中可以看出，所有杂交组合都能繁殖产生后代且后代雌雄比例正常，说明松材线虫和拟松材线虫可以杂交且它们产生的后代可育。国外的松材线虫和中国拟松材线虫也能相互杂交，甚至比本地杂交后代繁殖能力更强。如本试验中的美国松材线虫虫株和日本松材线虫虫株，他们与中国宜兴拟松材线虫虫株的杂交率和繁殖率都大于中国浙江松材线虫虫株，并且后代的死亡率也较低。

2.4 杂交后代的形态观察

镜检松材线虫和拟松材线虫各虫株杂交后代时发现部分线虫形态出现变异。成虫的变异具体的表现为，雄虫无交合刺或交合伞不发育; 雌虫尾部缢缩或弯折。正交和反交后代雌虫尾尖突平均长度相似，但长短各异，不稳定。

2.5 杂交后代的致病性测定

用各杂交组合的线虫后代接种2年生马尾松苗，所有杂交组合能使松苗发生萎蔫现象，并且最终表现出松材线虫病的典型症状。用无菌水浸泡萎蔫松苗分离线虫，结果见表 4。杂交组合Ch-Bx1×Ch-Bm, Ch-Bx2×Ch-Bm, Ch-Bm×J-Bx1, J-Bx1×Ch-Bm的杂交后代线虫接种后发病率较高。即南京溧水松材线虫虫株、浙江松材线虫虫株、日本松材线虫虫株与拟松材线虫杂交的后代对松苗致病性较强。美国松材线虫虫株与拟松材线虫虫株杂交的后代，即杂交组合Ch-Bm×A-Bx, A-Bx×Ch-Bm接种后对松苗的致病性最弱。所有杂交后代接种后再分离到的线虫数都远少于未杂交的亲本松材线虫。将这些再分离线虫用PSA培养的灰葡萄孢人工继代培养后在显微镜下观察发现67%左右的线虫活力较差，死亡率远高于亲本线虫。

3 结论与讨论

尽管本试验中，不同的杂交组合都会产生一些不正常的个体，这些畸形的个体有的不能产生后代，有的会很快死亡，但还有一部分杂交后代是正常的，甚至有的组合还有杂交优势存在。虽然杂交后代的活力较低，死亡率较高，但接种结果表明，部分活力强的杂交后代能在松苗内繁殖后代，对松苗存在一定的致病性。

刘伟等(1994)发现松材线虫的杂交率远低于松材线虫的繁殖率，所以认为在野外松材线虫会选择与自己种群进行繁殖，而不会与拟松材线虫杂交来扩大种群。本试验的结果表明拟松材线虫和松材线虫能成功杂交，杂交率都大于50%，而且它们产生的后代也可育，这就不能排除松材线虫在野外会与拟松材线虫进行杂交的可能。

Baujard(1980)发现法国海岸松(P. pinaster)上有松材线虫为害，但虫株的成熟雌虫具有拟松材线虫的形态特征，人工接种可诱发海岸松等幼苗产生强烈的病理反应，认为这些虫株属于松材线虫。而Mamiya等(1972)认为法国的这些虫株为拟松材线虫。季宏铁(2004)也认为，法国虫株应为拟松材线虫，只是它的雌虫尾尖突相对亚洲分离物稍短且对黑松(P. thunbergii)幼苗有较强的致病性。而Wingfield等(1983)首次从美国明尼苏达州的香脂冷杉(Abies balsamea)上分离到松材线虫类似物具有类似拟松材线虫的尾尖突和尾形，研究者也称之为“M”形松材线虫。在美国佛蒙特，Bergdahl(1988)从欧洲落叶松(Larix decidua)上分离到具有松材线虫、拟松材线虫特征的交合刺及阴门盖的一个虫株，该虫株的尾呈指形或否。用此分离物与欧洲赤松(P. sylvestris)上得到的松材线虫交叉接种证实两者对落叶松及松树具有致病性。而在加拿大魁北克的香脂冷杉上也得到类似于美国香脂冷杉的虫株。在日本，Mamiya等(1972)也发现至少存在7种类似于美国香脂冷杉上得到的“M”型虫株。

在我国，马承铸等(1996)报道在上海佘山发现了类似于Wingfield发现的M型松材线虫株系。此松材线虫株系是从佘山的濒死黑松上分离到的，这些线虫株系雌虫尾尖突长度达到2.5~6.0 μm，在形态上与拟松材线虫十分相似。但此株系对黑松有较强的致病性，且群体间杂交结果表明此株系可与典型的松材线虫株系杂交并产生后代。方光明(1996)报道江西省德兴市马尾松大量死亡，经林业部、江西省森防站、江西农业大学等专家实地调查并经症状观察和分离培养鉴定为拟松材线虫引起。

季宏铁(2004)在进行松材线虫与拟松材线虫的生物学杂交研究时，发现无论是正交还是反交，松材线虫种内杂交F1代数量并没有显著差异, 试验中也观察到一些组合的F1死亡率很高，甚至有些组合的F1代全部死亡; 用来源于法国和俄罗斯的各1个拟松材线虫群体不但能与拟松材线虫杂交产生可育后代，而且可以与来源于北美的部分松材线虫群体杂交产生可育后代，表明一些欧洲拟松材线虫群体，似乎处于松材线虫和拟松材线虫之间。

这些迹象均表明，松材线虫和拟松材线虫能够杂交，并且在一些地区已经形成群体。松材线虫和拟松材线虫在野外如果能够杂交，在研究病害流行学，在进行病害的诊断和执行检验工作时，都应该考虑这一现象的存在。