苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis), 简称Bt，其在形成芽孢的同时会在菌体的1端或2端形成蛋白晶体，这种蛋白晶体被称为杀虫晶体蛋白(insecticidal crystalproteins, ICPs)或δ-内毒素(delta-endotoxin)。因ICPs具有杀虫高效、广谱、对人畜无害等优点，Bt已广泛应用于害虫防治，主要用来防治鳞翅目、双翅目和鞘翅目的某些种类的害虫(刘石泉，2008)，近年来又发现Bt对其他目(如膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目、虱目和蚤目)昆虫以及鞭毛虫、线虫、蜱螨、原生动物有毒杀活性，杀虫谱扩大到昆虫纲的9个目(Chattopadhyay et al., 2004；Whalon et al., 2003)。但有关对蛀干害虫松墨天牛(Monochamus alternatus)有毒力的苏云金杆菌还未见报道。

松墨天牛是重大森林植物检疫性病害——松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)病的主要媒介昆虫和森林蛀干害虫。松材线虫病已累计给我国造成直接和间接损失超过300亿元(潘宏阳，2007)。防治松墨天牛，切断松材线虫的侵染循环是松材线虫病综合治理中的主要技术。本文应用17个苏云金杆菌菌株对松墨天牛2~3龄幼虫进行室内致死效果测定，以寻找有明显毒杀活性的菌株, 并对相关菌株生物学特性进行研究, 以期为松材线虫病的生物防治提供生物材料和理论基础。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

苏云金杆菌RBT-200701, RBT-200702引自俄罗斯国立应用微生物研究中心；其他菌株CT-43，CT-43-55，CT-43-7，F15，UW85，020，4Aa1，HD-1，1520，CTC，F-14-1，TR，007，1518，OF417引自华中农业大学农业微生物学重点实验室。

1.2 供试松墨天牛2~3龄幼虫

从浙江余杭锦江木业有限公司的待处理检疫木段中劈出松墨天牛幼虫，人工松木屑培养基(针叶树锯末260 g、蔗糖20 g、酵母粉12.5 g、琼脂15 g、苯甲酸钠2 g、山梨酸1 g、0.5 mol·L^-1硫酸10 mL、水400 mL)饲养幼虫，羽化后，室内饲养至产卵，卵孵化后，将幼虫挑出，饲喂松木屑，待幼虫长到一定龄期后备用。

1.3 孢晶混合物粉剂制备

菌株活化培养后，液体发酵培养至70%~90%晶体脱落，发酵液在5 000 r·min^-1、4 ℃离心15 min收集沉淀物，冷冻干燥，制成孢晶混合物粉剂。

1.4 菌株毒力测定

使用混合饲料感染法:称取灭菌人工松木屑培养基300 g，各菌株孢晶混合物粉剂300 mg，混合均匀，孢晶混合物含量为1 000 μg·g^-1培养基，分装成20份于小试管中，每个小试管中装1头松墨天牛2~3龄幼虫，管口用封口膜封好，25 ℃，65%~75%湿度下饲养观察，每隔3天统计1次死亡数，1个菌株做3次重复，用未做处理人工松木屑培养基作对照。

1.5 从死虫中分离培养Bt

死亡松墨天牛幼虫在无菌水中清洗1次，次氯酸钠(NaClO)消毒液中漂洗1次，无菌水清洗3次。将消毒后的死虫置于无菌、干燥的离心管中，加入无菌水，在超净工作台内研碎振荡制成悬液；取出活虫1头，制成悬液作为对照。用接种环取一环上述悬液在平板上划线接种，30 ℃恒温培养，每隔12 h，用芽孢染色法，涂片镜检(钱存柔，1999)，观察记录。

1.6 不同浓度孢晶混合物对松墨天牛的毒力影响

根据预试验测定的有效含量范围，配制一系列浓度孢晶混合物：2 000, 1 000, 500, 250, 125 μg·g^-1培养基。毒力测定方法同1.4。

1.7 发酵条件筛选

1) 培养时间  将菌种活化后，按1%(V/V)的接种量转接到PM发酵培养基(pH7.2)中，在30 ℃、200 r·min^-1条件下分别培养4, 8, 12, 20, 28, 36, 40, 48 h，每处理重复3个，用血球计数板计数苏云金杆菌孢子含量(下同)。2)培养温度  将菌种活化后，按1%(V/V)的接种量转接到PM发酵培养基(pH7.2)中，分别于15, 20, 25, 30, 35 ℃，200 r·min^-1条件下培养36 h计数。3)酸碱度  将菌种活化后，按1%(V/V)的接种量转接到pH值分别为4.8, 5.6, 6.4, 7.2, 8.0的PM发酵培养基中，200 r·min^-1、30 ℃培养36 h计数。4)震荡速度  将菌种活化后，按1%(V/V)的接种量转接到pH值为7.2的PM发酵培养基中，转速分别为140, 160, 180, 200, 220 r·min^-1下30 ℃培养36 h计数。

1.8 毒力菌株形态和培养特征观察

将菌种活化后，按1%(V/V)的接种量转接到pH值为7.2的PM发酵培养基中，在30 ℃下，200 r·min^-1摇床上振荡培养，每隔5 h取样，通过石炭酸复红染色，芽孢染色观察1次。

1.9 Bt伴孢晶体蛋白制备及SDS-PAGE鉴定

Bt伴孢晶体蛋白制备参考邹雪等(2001)、邓干臻(2004)试验方法，用PM培养基培养各菌株至孢晶完全分离，离心收集孢晶混合物。

SDS-PAGE鉴定：3%的浓缩胶，8%的分离胶，浓缩胶采用20 mA的恒定电流，分离胶采用10 mA的恒定电流，直接用一步式蓝色PAGE染液(溶液A、溶液B按4:1混合，溶液A在使用前要充分摇晃，溶液A, B购自绵阳高新区天泽基因工程有限公司)染色，用去离子水脱色，观察。

2 结果与分析 2.1 17个苏云金杆菌菌株对松墨天牛的致死作用

17个菌株孢晶混合物对松墨天牛2~3龄幼虫致死结果见表 1、图 1，从中发现作用20天后大部分菌株孢晶混合物对松墨天牛的活性比较低，死亡率在40%以下，仅有2个菌株(RBT-200701，RBT-200702)的孢晶混合物活性比较高，校正死亡率大于70%。2菌株对松墨天牛的2~3龄幼虫抑制作用明显，死亡幼虫身体发黑、僵直，体壁破后有黑色液体流出；未死亡幼虫不能正常取食、蜕皮、生长。

2.2 死虫Bt镜检情况

2个菌株培养12 h后，平板上长出小而圆的乳白色菌落，其边缘不整齐，表面毛毡状；培养24 h以上，菌落渐变扁平，表面有放射状皱褶，无光泽，边缘不整齐。经芽孢染色，油镜下连续观察其特点(图版Ⅰ)。

2.3 菌株RBT-200701, RBT-200702对松墨天牛的致死作用

对2个菌株不同浓度孢晶混合物对松墨天牛的校正死亡率回归分析(表 2)。从表中可以看出不同菌株不同处理时间毒力回归方程的相关系数均大于0.9，说明不同浓度孢晶混合物和松墨天牛的校正死亡率之间相关性很强；孢晶混合物浓度的对数和松墨天牛的校正死亡率成正相关，随着时间的延长杀虫效果提高。

2.4 发酵条件筛选结果

由图 2A可知，培养24~36 h时是菌株RBT-200701, RBT-200702的菌落增长期，培养36 h后菌量降低，故确定培养36 h为菌株RBT-200701, RBT-200702最适培养时间。由图 2B可知试验设计的5个温度中30 ℃最有利于菌株孢子产生和积累；温度高于或低于30 ℃均抑制孢子的产生；从图 2C可看出菌株pH在7.0~8.0之间均可较好地生长，pH7.2为菌株RBT-200701, RBT-200702发酵初期最适的培养酸碱度。由图 2D可知，200 r·min^-1为供试菌株RBT-200701, RBT-200702培养的最佳振荡速度。振荡速度大于或小于200 r·min^-1时孢子含量均下降。

2.5 菌株的形态特征

从表 3可知这2个菌株营养细胞特征、芽孢特征、菌落特征基本是相同的，主要的区别是营养细胞平均长度RBT-200702比RBT-200701大10 μm左右，RBT-200702产生的伴孢晶体少数游离，主要是长方形，而RBT-200701产生的伴孢晶体大多数游离，主要是菱形。

2.6 Bt晶体蛋白SDS-PAGE电泳分析

将2菌株的伴孢晶体蛋白分离纯化后，进行SDS-PAGE电泳，从图 4中可以看出2个菌株的电泳图谱相同，都有2条明显的条带，其分子量分别为65, 125 ku左右。

3 结论与讨论

Bt的杀虫毒力活性大多或完全依赖于ICPs(依昆虫而定)，但芽孢起着致病作用，当中肠受伴胞晶体损伤后，活芽胞便萌发成营养体，穿透肠壁进入血液，并在那里大量繁殖，使害虫患败血症死亡(Schnepf et al., 1998)；下一步将从菌株RBT-200701, RBT-200702孢晶混合物中分离提取纯伴孢晶体和活芽孢，按不同比例混合对松墨天牛毒力测定，并结合病理切片电镜分析技术，分析2菌株活芽孢是否起致病作用。

在以往的研究中大多数Bt菌株是对马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora)、金龟幼虫等鞘翅目昆虫或鳞翅目害虫有作用(李平，1994；程建新等，2000；竺莉红，2002；蔡鸿娇等，2002)。杜孟芳(2002)曾经筛选出1株对光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)有高毒力的Bt886菌株；任桂芳(1991)利用苏云金杆菌对双条杉天牛(Semanotus bifasciatus)幼虫进行了防治试验，取得了良好的杀虫效果。但尚未报道对松墨天牛害虫有高毒力的Bt菌株。本文筛选的2种对松墨天牛2~3龄幼虫有高毒力Bt菌株，又填补了Bt杀虫谱上的一项空白，为松材线虫病的防治提供了一个新的途径，将为Bt毒蛋白基因工程和林木抗虫育种研究提供一定的理论基础。

Bt毒蛋白对松墨天牛2~3龄幼虫表现较高的杀虫活性，而Bt毒蛋白对松墨天牛2~3龄幼虫引起的明显拒食现象，进而影响幼虫正常的生长发育，同样起到了阻碍害虫取食危害。SDS-PAGE蛋白分析发现这2个菌株的晶体蛋白图谱不同，都有2条明显的条带，分子质量分别为65, 125 ku左右；其中是哪一分子质量蛋白在毒杀中起着决定性作用，还需要进一步分析。

2个菌株最优发酵条件为30 ℃、pH7.2、振荡速度200 r·min^-1、培养时间36 h。为菌株继续深入研究和以后产业化扩大培养提供了理论基础。