沙柳木蠹蛾(Holcocerus arenicola)属鳞翅目(Lepidoptera)木蠹蛾科(Cossidae)线角木蠹蛾属(Holcocerus), 是危害荒漠地区沙柳(Salix psammophila)、踏郎(Hedysarum mangolicum)、沙棘(Hippophae rhamnoides)、毛乌柳(Salix cheilophila)、柠条(Caragana sinica)等灌木林的主要钻蛀性害虫之一。该虫广泛分布于我国陕西、内蒙、新疆、宁夏、甘肃等地的荒漠区域, 国外分布于小亚细亚、外高加索、中亚细亚、阿富汗、蒙古等地(胡忠朗等, 1987；谢文娟, 2008)。该虫4年1代, 幼虫群集, 常数十头拥挤在一个蛀道内蛀空根径部, 导致被害林木大片死亡, 大大降低了灌木林在荒漠地带的防风固沙作用。

由于沙柳木蠹蛾幼虫钻蛀于寄主的根部, 化学农药难以到达为害部位, 防治效果欠佳。利用昆虫性诱剂诱杀害虫具有灵敏度高、专一性强、不伤害天敌等优点, 已经被广泛应用于害虫监测、种群时空动态变化、害虫暴发和危害风险评估等领域(苏建伟等, 2005)。沙柳木蠹蛾性诱剂的研究在国内外尚属空白, 开展沙柳木蠹蛾性诱剂方面的研究有着重要的理论意义和实用价值。因此, 笔者对沙柳木蠢蛾的性腺体提取物进行了分析, 并利用人工合成的性信息素配制成不同比例和不同剂量的诱芯, 通过林间诱蛾活性试验, 确定了对沙柳木蠹蛾有较强引诱活性的性信息素成分、最佳配比和使用剂量。

1 材料与方法 1.1 昆虫的采集与性信息素的提取

2008年5月15日—5月20日, 在陕西省榆林市巴拉素镇林场, 选择被沙柳木蠹蛾严重为害的沙柳, 自其根部挖出沙柳木蠹蛾蛹后取40 cm×60 cm× 30 cm的纸箱, 内装含水量8%的沙土, 将沙柳木蠹蛾蛹埋于其中, 每纸箱放蛹50头, 蛹体距沙土表层5 cm, 撕去纸箱顶盖, 用窗纱覆盖纸箱上口。带回实验室后将纸箱放于2 m×2 m×2 m的纱笼内, 保持自然温度, 每天用喷雾器向沙土表面喷洒清水, 以表面湿透1 cm为宜, 光周期同自然光周期。

成虫羽化后, 立即将雌雄分开, 分别放入2个80 cm×80 cm×80 cm纱笼内。该雌蛾羽化当晚即具有求偶召唤行为, 高峰期为21: 00—22: 00；因此在婚飞召唤前0.5 h, 捕捉处女雌蛾, 用手轻挤其腹部末端, 使其产卵器外翻, 用镊子摘取性信息素腺体和产卵器, 浸入2次重蒸正己烷中。提取液用N₂吹扫浓缩至10 μL, 放入-10 ℃冰箱中保存。

1.2 性信息素提取物的气谱气相色谱(GC)分析

GC分析在Agilent 6890 N型色谱仪上进行, 其配有无分流进样器, 氢火焰离子检测器(FID), HP-5石英毛细管色谱柱(5% phenyl methyl siloxane 30 m × 0.32 mm i.d., 0.33 μm, Palo Alto, CA, USA)。升温程序为:起始温度100 ℃, 保持1 min, 然后以6 ℃·min^-1的速率升温至200 ℃, 再以10 ℃·min^-1的速率升温至240 ℃, 保持10 min。进样器和检测器的温度均为250 ℃。

1.3 性诱剂的人工合成

根据气相色谱对性腺体提取物的分析结果(主要成分为不饱和十四碳烯醇或其乙酸酯), 通过羰基烯化反应和炔化物路线制备了相应的性信息素标准化合物, 经过减压蒸馏和硅胶柱色谱纯化使纯度>95%, 以备电生理测试和田间诱蛾试验使用。4种主要成分的合成路线如下(图 1~3)。

1.4 合成标准化合物的电生理反应测试

将合成的性诱剂化合物用重蒸正己烷配成浓度为1 ng·μL^-1的单组分及二元组分溶液, 用触角电位仪(荷兰SYNTECH公司生产的IDAC-232触角电位仪)测定雄蛾触角对这些化合物的电生理反应值。取羽化当天的沙柳木蠹蛾雄蛾, 用眼科剪刀将触角自基部2 mm处剪下, 切除末端1 mm, 用电极胶(Beta360 electrode gel)将其横接在2个电极上；然后将所合成的化合物滴在3 mm×30 mm的对折滤纸条上, 装入样品管中。测定时采用的刺激控制装置为CS-05, EAG探针的内部放大系数为10×, 刺激气体流量为20 mL·s^-1, 刺激时间为0.1 s, 刺激间隔为40~60 s, 记录触角所产生的电信号, 以气化的正已烷为空白对照(成小芳等, 2006；王鸿斌等, 2006；张金桐等, 2000), 每个样品重复测试6次。合成化合物的触角电位测试值与对照平均值的差值作为测试物触角电位的绝对值, 6次触角电位测试的绝对值取平均值后进行比较研究(孔祥波, 2005)。

1.5 性诱剂诱芯的配制和林间诱蛾试验

按气相色谱分析得到的各成分间比例, 将合成的性诱剂各组分配制成单组分、二元组分和三元组分的诱芯用于林间试验。配制时将合成的性诱剂及其类似物溶解于正己烷中, 按需要制成不同浓度的溶液, 用移液枪将性诱剂溶液定量注入复合橡胶诱芯载体(中国科学院动物研究所孟宪佐提供), 待溶剂挥发后即成诱芯, 用聚乙烯保鲜膜密封, 低温保存备用。以含有正己烷的诱芯载体作为对照组的诱芯。诱捕器用塑料瓦棱板制成(30 cm×30 cm×30 cm, 棱长40 cm)(图 4), 将一块涂有粘虫胶的硬纸板(28 cm×35 cm)插入诱捕器底部, 用大头针将诱芯钉于胶版中央。诱捕器悬挂于受害沙柳林的上风口, 悬挂高度为1~1.5 m, 诱捕器之间相距约50 m, 每浓度试验处理设6个重复, 同时设置处女雌蛾诱捕器及空白对照。

林间诱蛾活性试验分别于2008年7月和2009年7月在陕西省榆林市巴拉素沙区林场进行, 共设计3项试验: 1)单组分和多组分的诱蛾活性测试, 以找出诱蛾活性较高的性诱剂成分组合; 2)各组分优化配比试验, 即比较不同配比间的诱蛾活性、确定最佳的组分配比; 3)最佳组分的剂量试验, 以前2项试验所确定的最佳组分配比进行单诱芯附载剂量试验, 测试不同剂量对诱蛾活性影响(张金桐等, 2001), 并最终确定用于防治沙柳木蠹蛾的性诱剂方案。前2项试验每3天更换1次诱芯和粘胶板, 并记录各诱捕器3天的诱蛾量, 取平均值后比较各处理的单诱芯平均诱蛾量。第3项试验的粘胶板每日更换, 诱芯持续使用10天, 记录各剂量中单诱芯在10天内的诱蛾量, 6个重复取平均值后进行比较。

1.6 数据处理

采用SPSS 13.0(SPSS Inc., Chicago IL)统计软件对数据进行处理, 诱捕数据经lg (x+1)转换后进行单因素方差分析(ANOVA), 各处理的平均值采用Duncan多重比较法检验差异显著性(α=0.05)。

2 结果与分析 2.1 GC分析结果

处女雌蛾的性腺体提取物经过GC分析, 结果见图 5。通过改变色谱柱的升温程序, 在不同的气相色谱条件下, 对信息素提取物和一系列标准化合物进行了分析和比较。结果表明, 峰Ⅰ~Ⅴ的保留时间(min)与标准化合物Z7-14: OH(Ⅰ)、Z5-14: Ac(Ⅱ)、Z7-14: Ac(Ⅲ)和Z9-16: Ac(Ⅳ)的保留时间一致。在提取物中分别加入等量的Z5-14: Ac和Z7-14: Ac后, 峰Ⅱ、峰Ⅲ的面积和峰高均随之增加, 表明提取物中可能存在这2种物质。通过比较各峰的积分面积, 峰Ⅰ~ Ⅳ的相对含量之比为24:39:100:43。

触角电位共测定了16种标准化合物, 从这些标准化合物的EAG反应可以看出(图 6), 雄蛾对Z7-14: Ac(4.73 mV)和Z5-14: Ac(3.48 mV)的EAG反应最强, 与其他15种物质相比差异性显著；其次为E7-14: Ac(2.85 mV)、Z3-14: Ac(2.76 mV)、和Z9-16: Ac(2.42 mV)。虽然Z3-14: Ac和E7-14: Ac也表现了较强的EAG反应, 但在性信息素提取物的GC分析中未检测到。图 6还表明, 乙酸酯类的EAG值远大于相应的醇类, 差异极显著(P < 0.01)；Z式化合物的EAG值大于E式的EAG值, 差异显著(P < 0.05)。

在二元组分的混合物中, Z5-14: Ac + Z7-14: Ac的EAG反应值最高, 达6.27 mV(图 7)；而Z7-14: OH + Z9-16: Ac的反应值最低, 为3.41 mV；含有Z7-14: Ac的二元物, 其EAG反应值明显高于其他二元物；所有二元混合物的EAG值均高于其单一组分。

2.2 单组分及混合组分的林间诱蛾效果

各性诱剂单组分、二元组分和三元组分的诱蛾活性测试效果见表 1。可以看出, 在单组分性诱剂的各处理中, C1处理有较强的诱蛾活性, 与处女雌蛾的诱捕量差异不显著；C2, C3和C4处理诱蛾量与对照差异不显著；C5两组分处理诱蛾量与单组分诱蛾量相比差异显著, 说明Z5-14: Ac也是沙柳木蠹蛾的性信息素成分之一。三元组分的C6和C7处理的诱蛾效果与C5的诱蛾效果差异不显著, 说明Z7-14: OH和Z9-16: Ac对C5两组分处理没有显著的增效或者抑制作用。总趋势表明, 二元组分和三元组分的诱蛾效果均高于单一组分的性诱剂, 差异性达到显著水平。

在表 1中三元组分C6的诱蛾效果最好, 据此进一步进行的各组分优化配比试验结果表明(表 2)。在第1组处理中, 随着Z5-14: Ac比例的增加诱蛾量也增多, R3, R4 2处理与R1, R2之间差异性显著, R3和R4相互之间差异性不显著；在第2组处理中随Z7-14: OH比例的增大诱蛾量增加不明显, S5~S8 4个处理间的差异性不显著。综合表明R3, R4, S5, S6, S7, S8六个处理之间的诱蛾活性无显著性差异, 考虑到各化合物的合成成本, R4组分的比例应为最佳配比。

2.3 剂量对诱蛾活性的影响

最佳组分R4的使用剂量试验表明, 单诱芯中性诱剂的含量越高, 其诱捕的雄蛾数量越多(表 3)。但剂量为1 520 μg的D8处理与D7, D6, D5, D4在10天内平均诱蛾量之间的差异性不显著。因此, 在保证较高诱蛾活性的前提下, 应选择剂量较低的D4(760 μg)用于沙柳木蠹蛾的虫情测报和诱杀。

3 结论与讨论

在木蠹蛾科的昆虫中, Z7-14: Ac曾被鉴定为沙棘木蠹蛾(Holcocerus hippophaecolus)(Fang et al., 2005)的性信息素成分之一, Z5-14: Ac也被鉴定为沙蒿木蠹蛾(Holcocerus artemisiae)(Zhang et al., 2009)的性信息素成分之一, 但这2种昆虫的性信息素中还含有Z5-12: Ac, E3-14: Ac等主要成分, 这些成分在沙柳木蠹蛾的性腺提取物中并没有发现。另外, Z7-14: Ac和Z5-14: Ac分别在卷蛾科(Tortricoidea)的Epitymbia alaudana(Horak et al., 1988), Ctenopseustis servana, Planotortrix excessana(Foster et al., 1988)及Planotortrix flammea(Foster et al., 1990)的性信息素鉴定中有过报道, 但其组成和比例与沙柳木蠹蛾性腺提取物差异较大。

单组分和多组分的诱蛾活性测试证明, 二元组分C5(Z7-14: Ac + Z5-14: Ac)的诱蛾活性远高于单组份的C1(Z7-14: Ac), 说明Z5-14: Ac的加入对Z7-14: Ac诱蛾活性有极大的增强作用。EAG测试表明此二元组分的EAG反应值最大, 远高于其他二元组分。2个试验的结果相符, 均证明这2个组分之间在生理活性上存在着极强的协同效应。在林间诱蛾试验中, 根据各处理诱捕数据的统计分析结果, 综合经济核算最终优选出以Z7-14: Ac, Z5-14: Ac和Z7-14: OH 3种化合物按10:8:1配制成附载剂量为760 μg的性诱剂诱芯, 用于沙柳木蠹蛾虫情监测和林间诱捕, 为荒漠地区沙柳木蠹蛾的无公害防治提供了可行性。

在各组分优化配比试验试验中, R2中2组分(Z7-14: Ac和Z5-14: Ac)的比例与性腺提取物一致, 均为10:4；R3, S5, S6, S7, S8 5个处理中2组分的比例为10:6, 但这5个处理的诱蛾活性均明显高于R2处理。即从诱蛾活性上讲, 按照提取物分析结果配制的性诱剂并不是最佳配比。这种误差可能因本研究采用的性信息素提取手段和方法所致, 不同的溶剂、浸提时间和提取方法所得出的结果不尽相同, 例如分别利用固相微量萃取法和溶剂浸提法收集棉铃虫性信息素, 主要组分含量的差异达7倍, 各组分间的平均相对比例差异均极显著(鲁玉杰等, 2001)。因而, 沙柳木蠹蛾性信息素的精确组成及结构, 尚有待于利用性信息素顶空收集法、毛细管气相色谱-触角电位测定联用(GC-EAD)、毛细管气相色谱-质谱联用(GC-MS)和微化学反应等技术进一步分析鉴定。