朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是一类危害严重的植食性害螨, 在我国分布广泛, 因其具有繁殖力强、世代周期短等特点, 极易产生抗药性(郑小江等，1997)。在过去30年中，其对作物造成的危害明显加重，主要原因之一是大量使用非专一性杀螨剂，这些杀螨剂往往杀螨活性不高，在杀螨的同时也消灭了螨类天敌; 同时造成了环境污染、抗性的产生等诸多问题。因此，使用选择性高的新型杀螨剂成为防治植食性螨类的主要措施之一(杨会芝等, 2007)。随着科学和社会的发展，人们已经不再注重“杀死”，而是注重“调节”，即合理利用生态的新方法来有效控制害虫, 开发对有害生物高效、对非靶标生物安全、易分解且分解产物对环境无损害的生物农药, 从生物中提取、分离新的天然活性化合物成为了开发新农药的重要途径(郑和斌等，2006)。植物源农药具有广谱、低毒、安全等优点，自然界许多植物中都含有杀螨活性物质，因此植物源杀螨剂的研究开发成为了其中的一个重要的内容。

大戟狼毒(Euphorbia fischeriana)又名猫眼草，是大戟科大戟属的一种有毒植物，多年生草本植物，长于草原、向阳山坡，产东北、华北，有广大的生长面积，资源充足。目前, 对大戟狼毒的研究在医药(江苏新医学院, 1986)和杀虫方面都有报道，徐德昌等(2004)用大戟狼毒根乙醇提取物对甘蓝夜盗(Barathra brassicae)进行室内杀虫试验; 顾雅静等(2007)对其杀螨活性进行了初步研究。为了全面了解大戟狼毒对农业有害生物的作用特点, 本文系统测定了大戟狼毒不同部位提取物对朱砂叶螨卵和雌成螨的触杀活性，并进一步进行了系统的分离提纯，为经济、安全、有效的新型杀螨剂的开发提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试材料

试验所用大戟狼毒采山西省沁水县中村镇(7月)，按植物的不同部位进行采集(根，茎，叶)，将采集的各部分植物材料洗净后在室内阴干(约25 ℃)，放入恒温箱内(40~45 ℃)烘干，磨碎，过60目筛，放入冰箱中储藏备用。

朱砂叶螨为室内饲养的敏感品系:养虫室的温度(25±1) ℃，相对湿度(50±10)%，光照(L:D)为18 h:6 h。

1.1.2 化学药品

石油醚、三氯甲烷、甲醇、硅胶、吐温-80、石英砂。

1.1.3 主要仪器

可裁剪型硅胶板、便携式荧光灯、SHZ-D循环水式真空泵、薄层层析展开缸、双目立体显微镜(160×)、RE-52C旋转蒸发仪、层析柱、1702-MP8型电子天平。

1.2 提取与分离方法 1.2.1 提取方法

采用冷浸法:准确称取一定量的植物干粉，装入广口瓶内，加入干粉5倍量的有机溶剂(石油醚、氯仿、甲醇)，室温下分别浸提3次，每次3~5天，减压浓缩，合并3次的提取物，称量。

1.2.2 活性成分的分离

1) 萃取分离 采用液-液分配法室内生测结果表明：大戟狼毒根石油醚提取物(E. fischeriana petroleum ether extract, EFPE)生物活性最强，因此，对其进一步分离纯化。称取大戟狼毒根石油醚提取物5 g，用10倍量的氯仿溶解，装入分液漏斗中，依次用石油醚、甲醇、水3种溶剂各萃取3次，分别合并萃取液，减压浓缩至稠膏状，称量。

2) 柱层析分离 采用常压柱层析法。取萃取物7g用少量初始洗脱液使之充分溶解，待柱内溶液表面距硅胶表面1 cm左右时，用吸管将待分离物质沿柱内壁均匀地加入，等需分离物质移动到硅胶表面以下时，覆盖一层石英砂，然后依次用不同极性的洗脱液淋柱。

洗脱液的流速为每秒3~4滴，每流分收集50 mL，共得流分287个，经薄层层析(TLC)后，置于荧光检测灯(254，356 nm)下检测，做好标记。将相同成分者合并，最终得到流分16个。将16个流分减压浓缩后，进行生物活性测定，确定活性成分所在部位。

1.3 生物活性的测定 1.3.1 触杀作用

玻片浸渍法(FAO，1980):用双面胶带纸将健康活泼、大小一致的雌成螨背部向下粘于载玻片的一端，并在解剖镜下剔除死亡或受伤个体，保证每玻片叶螨数为30头，在药液中浸5 s后取出，用滤纸轻轻吸掉浮药，于24 h后观察其死亡情况，接触动者为活，不动者为死，计算校正死亡率。

1.3.2 杀卵作用

叶片残毒法(朱丽梅等, 2002):采集新鲜的苹果(Malus pumila)叶片，叶柄截去0.5 cm，并在叶柄上包上湿棉球，放在水培养台上，每片叶片接雌成螨20头，置于(25±1)℃下任其产卵24 h，去除雌成螨，检查记录卵粒数后，置于25 ℃恒温培养箱中，当卵龄达到36~48 h时进行测定，将带卵的叶片浸入各处理药液5 s，然后放在吸水纸上阴干，放回水培养台上，待对照组卵孵化并发育至若螨阶段，约120 h后检查统计各处理死亡率。

1.4 分析方法

将所得数据用Finney机率分析法求出毒力回归式, 并对该方程式进行卡方适合性检验。当回归式符合实际情况后, 求出LC₅₀以及LC₅₀的95%置信限。所有数据采用EXCEL和SPSS软件处理。

2 结果与分析 2.1 最佳活性部位及提取物的确定

从表 1可以看出，用3种极性递增的溶剂分别对大戟狼毒各部分进行提取，提取率随着溶剂极性的增强而提高，大戟狼毒3个部位不同溶剂提取率由高到低依次为甲醇>氯仿>石油醚，且甲醇与其他2种溶剂提取率之间差异显著。

将大戟狼毒各部分不同溶剂提取物配制成质量浓度为4和1 mg·mL^-1的溶液对卵和成螨进行生物活性测定(表 2), 根和茎的石油醚提取物对朱砂叶螨的卵和雌成螨有较高的触杀活性，24h后校正死亡率分别为55.21%和52.73%, 53.83%和46.19%，与其他提取物相比差异显著。

将大戟狼毒根和茎石油醚提取物配成5个不同质量浓度(4，2，1，0.5，0.25mg·mL^-1)，测定其对朱砂叶螨的触杀活性(表 3)，大戟狼毒根石油醚提取物对朱砂叶螨卵和成螨的LC₅₀分别为3.4112和0.7975 mg·mL^-1，茎为2.8951和0.8592 mg·mL^-1，根石油醚提取物比茎石油醚提取物对成螨有较好的生物活性。所以，选用大戟狼毒根石油醚提取物作进一步的萃取。

2.2 最佳萃取物的确定

采用液-液分配法对大戟狼毒石油醚提取物进一步萃取，对萃取物生物活性测定结果见表 4和表 5。从表 4，5可知，石油醚萃取率与氯仿和甲醇萃取率之间存在明显差异(P < 0.01)，萃取率依次为石油醚>氯仿>甲醇。且从对朱砂叶螨卵及成螨的触杀活性来看，石油醚对朱砂叶螨的卵和成螨24 h后的校正死亡率分别达到60.46%和64.80%，高于其他萃取物的校正死亡率，可见，石油醚是3种溶剂中提取和萃取大戟狼毒根有效活性成分的最佳溶剂。

将大戟狼毒根石油醚萃取物用对半稀释法配成5个不同梯度浓度(4, 2, 1, 0.5, 0.25 mg·mL^-1和1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.062 5 mg·mL^-1)，测定其对朱砂叶螨卵和成螨的触杀活性，求出毒力回归方程及致死中量(LC₅₀)见表 6。从表 6可以看出，石油醚萃取物对成螨有较高杀螨活性，其LC₅₀为0.6736 mg·mL^-1，并且也有一定的杀卵效果，LC₅₀达到了2.7343 mg·mL^-1。这表明大戟狼毒根石油醚萃取物具有很好的杀螨活性。因此，石油醚萃取物为最佳萃取物。

2.3 最佳流分的确定

采用常压柱层析对大戟狼毒根石油醚萃取物进行分离，共得到流分287个，经TLC检测后，相同成分合并得到16个流分。将这16个流分分别配成质量浓度为1mg·mL^-1的溶液，对朱砂叶螨卵及成螨进行生物活性测定，结果见表 7。从表中可以看出，卵的死亡率在50%以上的只有流分11，达到66.33%;成螨死亡率达到50%以上的有流分1，2，11，12，分别为68.59%，61.63%，84.67%，51.40%，其中以流分11的效果最好; 从提取率来看，流分11也比较高。综合来看，无论从提取率还是对卵和成螨的触杀活性，均以流分11的效果最佳。

用对半稀释法将流分11，简称EFPE-11(E. fischeriana petroleum ether extract)分别配成5个不同浓度对朱砂叶螨进行生测，毒力回归方程及致死中量(LC₅₀)见表 8。从表 8可以看出，EFPE-11对朱砂叶螨成螨有较好的触杀活性，LC₅₀达到0.423 4 mg·mL^-1，对卵有一定的触杀活性，LC₅₀为2.256 8 mg·mL^-1因此，确定EFPE-11为最佳流分。

3 结论与讨论

目前, 对大戟狼毒的研究在医药方面较多。狼毒大戟为大戟科狼毒大戟的干燥根, 为中药狼毒的来源之一, 临床用于治疗肿瘤、结核病和皮肤病等(刘文粢等，2001)。其中所含黄酮类成分具有多种生理活性, 例如:扩张冠状血管、降低胆固醇、降低血管脆性、止咳、平喘、祛痰、抗菌、消炎等作用(刁幼林等, 2001), 为土农药的历史也已久远。本文研究了大戟狼毒的杀螨活性。其中流分11对卵和成螨都有较高的触杀活性，24 h校正死亡率分别达到66.33%和84.67%。LC₅₀分别为2.256 8和0.423 4 mg·mL^-1。研究发现, 用EFPE-11处理成螨后, 整个身体肿胀，体表光滑，部分螨的胴部内含物外泄，而且药剂对不同螨态的作用效果不同, 造成这种差异，可能与朱砂叶螨各螨态的生理生化代谢和体表结构不同有关，需进一步研究其作用方式和生化机制。

对于大戟狼毒化学成分的研究, 国外报道其中含有甾醇、氨基酸(熊莹，1990; 邢有权, 1990)，近年国内又发现了一些成分，辽宁中医学院刘桂芳等从大戟狼毒中分离出8种化合物(中国科学院上海药物研究所, 1999); 黑龙江大学邢有权等又从中分离出邻苯二甲酸二酯(阚毓铭, 1988)。张彦龙等(2002)首次从大戟狼毒中分离出极微量化学成分3, 7, 11-十三烯酸-4, 8, 12-三甲基甲酯。马晴高等人对大戟狼毒羽扇豆醇乙酯和没食子酸进行分离鉴定(刘文粢等，2003)。其中大戟狼毒内的狼毒素，狼毒碱等具有杀虫活性。到目前为止, 大戟狼毒的杀螨活性成分分离还处于初级阶段，药剂对朱砂叶螨作用的活性物质是否是以上分离出的化合物或狼毒素，还需进一步的分离纯化和结构鉴定。