皮暗斑螟(Euzophera batangensis)，俗称甲口虫，属鳞翅目螟蛾科，分布于我国及日本等亚洲国家，食性杂，其幼虫主要喜食幼嫩的愈伤组织，可为害枣树(Ziziphus jujuba)、木麻黄(Casuarina equisetifolia)、枇杷(Eriobotrya japonica)、梨(Pyrus bretschneideri)等多种林果树木(王思政等，1993；杨振江，1995；黄金水等，1995)。在我国河北、山东、河南等省枣树集中栽培区，由于农民采用开甲技术来保持枣树的早产稳产，这样每年在树干上形成大量的幼嫩愈伤组织，为皮暗斑螟提供了充足的食物，导致近年来皮暗斑螟危害愈来愈重，已经成为枣树的重要害虫。甲口受到此虫危害，轻者影响以后枣树生长和枣果产量，重者导致枣树整株死亡，迫使农民花费大量人力物力，每年使用剧毒农药涂抹甲口10余次，防治此虫，不仅成本高，而且污染环境。

皮暗斑螟大部分时间在皮下坑道中生活，主要蛀食树木形成层，蛀孔和坑道内充塞蛀屑，危害隐蔽，一般药物难以触及，对树体坑道内活动的各虫态害虫的防治造成一定的难度。因此，抓住成虫羽化后寻找异性交尾和扩散产卵这一在外面活动的关键时期进行防治是控制该虫危害的重要途径。皮暗斑螟成虫交尾主要是雄虫依靠感受雌虫释放的性信息素来寻找异性的，因此，通过研究雌虫的性信息素，进而研制出对雄蛾具有很好引诱效果的性引诱剂，不但可以用其对成虫发生期准确监测，指导其他防治措施的适时实施，还可以通过大量诱杀雄虫，使得雌虫因缺乏雄虫交尾，只能产下不能孵化的未受精卵，达到压低其种群数量，减轻其危害之目的。因此，研究利用该虫的性诱剂对其进行监测、检疫和防治是十分重要和必要的，具有显著的生态、社会和经济效益以及非常广阔的市场前景。

关于此虫的研究，以我国最多，以往主要对枣园、木麻黄和枇杷园中皮暗斑螟的生物生态学和防治方法等进行了研究(王思政等，1993；杨振江，1995；黄金水等，1995)，基本弄清了此虫的形态特征、危害特点、发生规律、寄主范围、生物学习性，提出了化学农药和使用线虫防治该虫的方法。近年来，国内外对此虫开始探索应用线虫和真菌进行防治研究(黄金水，1995a；1995b)，取得了一定的效果，但问题是线虫和真菌受天气影响较大，要求较高的空气湿度，否则难以成活。同时，线虫和真菌主动寻找寄主的能力较弱，在操作上，必须将线虫和真菌用注射器注射到坑道内距离皮暗斑螟较近处，否则效果不好。总之，生产实践中缺乏简便有效的监控和防治皮暗斑螟的无公害技术方法和手段。

应用性诱剂监测害虫发生和消长情况，具有灵敏度高、准确性好、操作简便、高效经济无毒、不杀伤天敌等特点，在世界各国已得到普遍承认，到目前已鉴定和合成了1000多种害虫的性诱剂(Witzgall et al., 2004)，有些已在测报和防治上大面积推广应用，但尚无皮暗斑螟性引诱剂的研究报道。本文在对该虫生殖生物学进行研究的基础上，首次对皮暗斑螟性信息素开展研究，弄清了该虫的雌性信息素组分，合成了皮暗斑螟性引诱剂，并通过田间诱捕试验，筛选出对该虫灵敏高效的性引诱剂。

1 材料与方法 1.1 皮暗斑螟生殖生物学 1.1.1 试虫来源

试验用皮暗斑螟采自正定县新城铺、献县南洋村和沧县朴寺枣园，多为老熟幼虫，少数为蛹。其中，正定新城铺枣园枣树为10年生的梨枣，株行距为3 m×6 m，面积3.9 hm²，管理水平一般；南阳村和朴寺枣园地处我国金丝小枣主产区核心位置，枣园集中连片，多为几十年甚至上百年枣树，有的地块套种5年以下的冬枣，株行距多为3 m×6 m，田间管理水平较高。将田间采集的老熟幼虫于实验室内人工气候箱中进行饲养，光照：黑暗为14:10，相对湿度为70%~90%，在25~15℃条件下用人工饲料喂养，直到化蛹。

1.1.2 成虫交尾习性观察

将新羽化的雌雄成虫1:1配对，分别放入不同的大口塑料瓶(直径15 cm，高20 cm，瓶口直径10 cm)中，瓶口盖上网眼为0.2 mm²的双层纱布(纱布上装有浸有10%蜂蜜水和清水的的医用棉球，供成虫舔食)，再用橡皮筋套好。记录交尾起始时间和结束时间、时长。待交尾结束后，将雄虫放入另一装有另一只未交尾雌成虫塑料瓶中，观测其有无二次交尾现象，如有，再次将雄虫放入另一装有未交尾雌成虫塑料瓶中，观测其有无再次交尾现象；同时将参与交尾的雌成虫放入另一装有未交尾雄成虫塑料瓶中，观测其有无二次交尾现象，如有，再次将雌虫放入另一装有未交尾雄成虫塑料瓶中，观测其有无再次交尾现象。

1.1.3 雄成虫趋性规律观测

在枣园设置三角形粘胶诱捕器20个，相邻诱捕器间距50 m以上，诱捕器为三角形，边长20 cm，棱长25 cm，底部放置规格为20 cm×25 cm的粘胶板，胶面朝上，用以粘捕皮暗斑螟雄成虫。用细铁丝一端穿透诱芯皮塞固定，另一端固定在诱捕器顶端棱中部，并使诱芯垂直下垂，诱芯距胶板约1 cm。放置好诱芯后每日每隔3 h调查一次诱捕雄虫数量。

1.1.4 成虫产卵习性

将交尾后的雌虫收集到另外的塑料瓶中，每瓶放雌虫1头，瓶内放入滤纸，供雌虫产卵。记录产卵日期和产卵量，待卵孵化后记录孵化日期和孵化幼虫数，统计孵化率，同时记录成虫死亡日期。

将没有交尾雌虫单独放于塑料瓶中，观测有无产卵现象，如有记录产卵日期和产卵量，观察所产卵孵化情况，同时记录成虫死亡日期。

1.2 雌性信息素成分分析 1.2.1 供试虫源

由沧县枣园采集皮暗斑螟老熟幼虫，放于捷克科学院生物有机化学研究所实验室进行饲养，光照条件：光照:黑暗为14:10，湿度为70%~90%，在25~15 ℃条件下用人工饲料喂养，直到化蛹。把雌雄蛹分开保存，羽化的雌成虫继续在恒温箱中饲养，雄成虫则转入5 ℃条件下饲养，待用。

1.2.2 雌性腺分泌物提取

从羽化1~2天的雌成虫中采集雌性腺。腺体的切除要在calling时期(喜暗结束期)进行。腺体切除前将雌成虫在-20℃条件下至少冷冻5 min，然后将雌性腺连同腹部第7、8节体节一同切除，放入己烷中浸泡2 h(每雌性腺10μL己烷)，提取物放在-20℃条件下储存备用。

1.2.3 GC-EAD分析

用羽化2~7天的雄成虫触角做GC-EAD试验。将雌性腺提取物样品完整地注入装配有一个DB－5柱(J&W Scientific，Folsom, CA，USA; 30 m×250 μm i.d.×0.25 μm film)的5890A Hewlet-Paceard气相色谱仪中。柱中液体的分离由一个4臂Graph-pack3D/2分离器将洗堤化合物输送到FID和EAD。GC先升温到50 ℃，保持2 min，然后以10 ℃·min^-1的速率升至270 ℃(保持10 min)。GC入口和探测头的温度分别设定为200 ℃和260 ℃。一组正烷烃(C₁₄—C₂₀，Sigma-Aldrich)与供试样品一同注入以测定触角电位有反应的化合物的Kovats指数(I_K)。

1.2.4 GC×GC/TOFMS分析

GC×GC/TOFMS分析在一台装配有静止四喷嘴低温调节器的LECO Pegasus4D设备上进行(LECO Corp.，St. Joseph，MI，USA)。一个弱极性的DB-5柱(J&W Scientific，Folsom，CA，USA; 30 m×250 μm i.d.×0.25 μm film)用于GC的第1维。第2维分析使用一个极性的BPX-50柱(SGE Inc.，Austin，TX，USA; 2 m×100 μm i.d.×0.1 μm film)。氦作为载体气体保持1 mL·min^-1的流速。主要GC炉的温度控制程序如下：50 ℃ 2 min，然后以10 ℃·min^-1的速率升至300 ℃，最后在300 ℃保持10 min。第2个GC炉的温度控制与第一个GC炉同步，但温度均高5 ℃。各阶段之间调整期，高温脉冲持续期和低温时间分别设置为3.0，0.4和1.1 s。连接到TOFMS探测器源的传输线操作温度为260 ℃。该源温度为250 ℃，灯丝偏压为-70 eV。数据获得频率为100 Hz(scans·s^-1)，质量范围为29~400 u。探测器电压为1 750 V。将1 μL样品一次性注入。入口温度为200 ℃。在60 mL·min^-1流速的条件下，净化时间为60 s。利用LECO ChromaTOF^TM软件连续不断地对质谱数据进行2D和3D可视化处理分析。与GC－EAD试验中一样，将一组不同分子量的正烷烃(C₁₄—C₂₂，Sigma-Aldrich)与供试样品同时注入，以测定被测物的I_k。

1.2.5 标样

分析用标准物在捷克科学院生物有机化学研究所实验室合成。所有的标准物经过瞬间色谱仪提纯后，置于痕量分析等级的己烷中保存，待用。

1.2.6 数量分析

为了测定系统探测的阈值，合成的(Z9，E12)-十四碳-9，12-二烯-1-醇(9Z，12E-14:OH)用己烷稀释为10 pg·μL^-1至2 ng·μL^-1的不同浓度。将不同浓度的十四碳烯醇各1 μL注入GC×GC/TOFMS中进行分析。人为地将各个峰综合起来，通过将峰区与相应的浓度标绘在一起，构建出一个校准曲线。

1.3 田间诱捕试验 1.3.1 性引诱剂配制及诱芯制作

性引诱剂为经过上述分析并经人工合成的雌性信息素化合物及其异构体，经过不同配比，制成皮暗斑螟性引诱剂，诱芯采用硅胶塞制作，田间诱捕试验用诱芯的性引诱剂成分和剂量见表 1、表 2。

1.3.2 诱捕器田间悬挂方法

田间诱捕试验使用的诱捕器为三角形粘胶诱捕器，其中三角边长9 cm，棱长22 cm，底部放置规格为9 cm×22 cm的粘胶板，胶面朝上，用以粘捕皮暗斑螟雄成虫。用细铁丝一端穿透诱芯皮塞固定，另一端固定在诱捕器顶端棱中部，并使诱芯垂直下垂，诱芯距胶板小于1 cm。放好诱芯后，将诱捕器用细铁丝固定在枣树底层主枝上(高度约1.3 m)，使诱捕器顶端棱靠近枝干，以尽量减少因风吹而引起的晃动，同时清理诱捕器周围枣树小枝条及枣吊，使其周围保持空旷。

1.3.3 试验设计与调查方法

试验共设3组重复，每组重复中每种处理各设一个诱捕器，即每个处理重复3次。每组中各个处理的诱捕器随机排列，为减少悬挂诱捕器的位置对试验结果造成的影响，采用随机的方法，每日更换诱捕器位置，实行单循环制。同一重复内相邻诱捕器间距为80~100 m，不同重复间诱捕器相距300 m以上。放置诱芯后第2日起，每日调查诱捕虫量，每5日更换1次粘胶板，持续调查40天。

1.3.4 数据分析方法

应用DPS数据分析处理软件对调查数据进行分析，首先对数据进行对数转换，然后进行独立、正态和方差齐性检验，再进行方差分析和多重比较，分析不同处理田间诱蛾量差异。

2 结果与分析 2.1 成虫生殖生物学 2.1.1 性比

田间调查发现幼虫老熟后即吐丝化蛹，蛹的颜色由淡黄逐渐变为深黄，成虫羽化前蛹多为褐黄色。经过对林间采集的431个蛹进行调查，雌雄性比为1:1.05。

2.1.2 羽化时间

室内饲养观测发现：成虫昼夜均可羽化，以日落前后2 h内最为集中(表 3)。4月16日至19日，田间采集的蛹中，共有9头成虫羽化，而且全部为雄虫，其中的5头集中在17：00至20：00羽化；5月12日至13日，羽化的6头成虫中，雄成虫4头，雌成虫2头，羽化的成虫中有3头集中在17：00至20：00羽化；5月15日至20日，羽化的20头成虫中，雄成虫11头，雌成虫9头，羽化的成虫中有8头集中在17：00至20：00羽化，6头集中在20：00至22：00羽化，而此6头成虫大多在20：00至21：00羽化。

2.1.3 成虫交尾习性

白天羽化的成虫可在当晚寻找配偶进行交尾，日落后羽化的成虫一般次日晚上交尾，成虫交尾时间大多出现在午夜至天明前。在室内饲养条件下，雌雄成虫均没有发现二次交尾现象。

2.1.4 雄成虫趋性规律观测

5月9日至13日、6月10日至11日，2次在沧县崔尔庄应用性引诱剂诱捕皮暗斑螟雄成虫，共诱捕到雄成虫23头，其中在24：00至凌晨3：00共诱捕到雄成虫16头，占诱捕总量的69.6%，说明雄成虫对雌性信息素的响应主要集中在24：00至凌晨3：00，这也与室内饲养条件下成虫交尾规律一致。

2.1.5 产卵习性

成虫交尾后一般于第2天产卵，卵单产或3~5枚卵成一卵块。同时林间调查也发现，成虫大多将卵散产在枣树甲口(伤口)附近的翘皮下。初产卵为乳白色，逐渐变为肉红色，直至变为褐红色，卵孵化前变为黑红色。卵孵化率在90%以上，孤雌产卵不能孵化。

2.2 雌性信息素成分分析

通过对皮暗斑螟雌性腺提取物进行GC-EAD分析(1FE)，结果清晰地显示出一个主要的EAD反应(图 1A)，此反应物大约位于十四—二十碳正烷烃标准物中C17位置(图 1E)。但是引起EAD反应的活性物质在普通GC的FID中没有检测到(图 1B)。因为鳞翅目螟蛾科昆虫雌性激素通常是含有一个或多个双键的直链C₁₂—C₁₄脂肪族酯、醇或醛类化合物，因此笔者测定了EAD反应区的Kovats指数(I_k，EAD)，并将其与饱和和单不饱和的醇、酯和醛的I_k列表值比较。使用DB-5柱测定的EAD的I_k，EAD为1 681，与表中所列的I_k均不接近，说明引起EAD反应的活性化合物与饱和或单不饱和的C₁₂—C₁₈醇、酯或醛之间没有关系。这个结果表明活性化合物分子中可能存在有额外的双键。使用双不饱和合成标准物做进一步的GC-EAD试验，发现雌性腺提取物中未知化合物的EAD反应保留时间与合成化合物9Z，12E-14:OH的EAD反应保留时间完全一致(图 1C，D)。这个化合物已经在Euzophera属的其他种类和一些其他鳞翅目昆虫的信息素组分中发现过(Maini et al., 1983；Biddinger et al., 1993；Bestmann et al., 1993)。但是，提取物的一维GC/MS分析未能提供任何相关的质谱以确认对该物质的鉴定，因为MS信号被深深地埋藏在背景噪音之中。另一方面，对EAD活性化合物区域的GC×GC/TOFMS分析发现了包括9Z，12E-14:OH在内的几种化合物(图 2A)。图 2A也显示出了柱渗出物高“墙”，在一维GC分析中它可能掩盖了被测活性物的峰，但是，该峰在二维GC×GC试验中被很好地与背景噪声分离开了。合成的9Z，12E-14:OH质谱和二维保留时间(图 2C，表 4)与雌性腺提取物中发现的活性成分完全一致。GC×GC/TOFMS检测的9Z，12E-14:OH的阈值约为10 pg。这样的敏感性与EAD的敏感性相当(10 pg即可引起明显的EAD反应)。在构建校准曲线的基础上的定量分析测定结果表明1个雌性腺中9Z，12E-14:OH的含量约为100 pg(表 5)。

对EAD活性区的GC×GC/TOFMS色谱的3D表面图区进行认真检查发现，除了9Z，12E-14:OH外(peak 1，图 2B；表 4)，还有一种可能为信息素组分的物质出现在9Z，12E-14: OH稍微前面一点的地方(peak 2，图 2B；表 4)。这种化合物的质谱和二维保留时间参数均与(Z9)-十四碳-9-烯－1醇(9Z-14:OH)完全一致，说明皮暗斑螟的雌性信息素可能有2种组分。通过对合成的9Z-14：OH、9Z，12E-14:OH和浓度更高的雌性腺提取物(5 FE)进行GC-EAD分析，结果证明了9Z-14:OH具有生理学功能。与9Z，12E-14:OH相比，10ng的9Z-14:OH引起的EAD反应虽然可以测出，但明显微弱(图 3)。

2.3 田间诱捕试验

2005—2007年连续3年对皮暗斑螟性引诱剂田间诱捕效果进行了观测(图 4，图 5)。2005和2006年田间诱捕试验结果(图 4)表明：在(Z，E)-9，12-14:OH，(Z，Z)-9，12-14:OH，(E，E)-9，12-14:OH，(E，Z)-9，12-14:OH 4种不同的异构体和Z9-14:OH等5种化合物中，只有(Z，E)-9，12-14:OH表现出了良好的诱蛾活性，Z9-14:OH也没有诱捕到任何雄蛾，这说明虽然EAD/GC测定表明Z9-14:OH有一定的生物活性，但其单体在田间对皮暗斑螟雄蛾的引诱作用不明显。不同剂量(Z，E)-9，12-14:OH诱蛾试验结果表明：剂量越大，诱蛾量越多。2种组分混合物的初步试验结果表明：在(Z，E)-9，12-14:OH中加入Z9-14:OH没有起到显著的增效作用。2007年重点对不同异构体与(Z，E)-9，12-14:OH的混合物的引诱效果进行了田间测定，由于皮暗斑螟种群密度仍然较低，总的诱捕数量并不是很多。在对不同诱芯的诱捕数量进行统计分析中，没有发现对(Z，E)-9，12-14:OH有显著促进作用的其他成分。但使用通过商业途径定制的(Z，E)-9，12-14:OH配制的500 μg剂量的诱芯显示出较好的引诱效果(图 5)。

尽管后2年皮暗斑螟田间种群数量较低，但2005至2007年连续3年的田间诱捕试验仍然可以证明(Z，E)-9，12-14:OH作为主要成分的皮暗斑螟性引诱剂诱芯对皮暗斑螟雄蛾具有显著的引诱作用，500μg剂量的(Z，E)-9，12-14:OH诱芯可以作为适宜的皮暗斑螟性引诱剂诱芯使用。

3 结论与讨论

通过以上研究，可以初步得出以下结论：

1) 皮暗斑螟成虫羽化高峰主要集中在日落前后，大多在凌晨至天亮前交尾，雄虫对雌性信息素的响应也多集中在凌晨0：00—3：00。室内饲养条件下，没有发现二次交尾现象。交尾后次日开始，雌虫将卵散产在甲口(伤口)附近翘皮下。

2) 皮暗斑螟雌性信息素可能包含2种化合物，主成分是(Z，E)-9，12-14:OH，次成分为9Z-14:OH。2种组分相比，(Z，E)-9，12-14:OH的触角电位反应较强，9Z-14:OH反应较弱。

3) 田间诱捕试验表明：(Z，E)-9，12-14:OH对皮暗斑螟雄蛾具有显著的引诱作用，(Z，E)-9，12-14:OH的其他异构体和Z-9-14:OH对皮暗斑螟雄蛾没有明显的引诱效果。

4) 研究过程中发现：全二维气相色谱-飞行时间质谱分析技术(GC×GC/TOFMS)较常用的普通气相色谱质谱分析技术(GC/MS)灵敏度和精度更好，在昆虫性信息素的研究中具有更大的优势。

由于在研究的后期，田间皮暗斑螟的种群数量较低(主要是由于农民认识到该虫的危害性，大量使用化学农药防治所致)，导致总的诱虫量较少，这可能对于正确评价皮暗斑螟雌性信息素中次要成分的作用产生影响。本文主要以枣园皮暗斑螟的种群为研究对象，其结果是否符合于木麻黄或枇杷林中的皮暗斑螟种群，也有待于今后的进一步试验研究。另外，关于皮暗斑螟性信息素在该虫预测预报和防治中的应用技术方法也是今后需要研究的内容。