我国松毛虫属(Dendrolimus)昆虫种类繁多，隶属于鳞翅目枯叶蛾科，其中的典型代表有马尾松毛虫(D. punctatus)、油松毛虫(D. punctatus tabulaeformis)、赤松毛虫(D. punctatus spectabilis)和落叶松毛虫(D. superans)等，给林业生产造成重大的经济损失。河北省承德市平泉县地处华北平原东北部，气候凉爽湿润，主要以油松(Pinus tabulaeformis)、华山松(Pinus armandii)和落叶松(Larix gmelinii)为主栽树种。由于适宜的气候条件，该地区油松毛虫每年均有发生。近年来当地林业部门采取化学防治与生物防治相结合的方法，油松毛虫的综合治理取得显著成效。由于常年的化学防治以及人为干扰，油松毛虫种群生境已经出现片段化。油松毛虫种群势必会在这种生存压力下产生相应的适应机制，其遗传结构也会发生一定的变异。这些遗传变异使用传统的研究方法通常很难发现，需要通过分子生物学技术来进行验证，不少学者已经对此开展了一系列的研究(张爱兵等, 2004; Ji et al., 2005a；2005b)，以此来为生产实践提供理论指导。

SSR (simple sequence repeat)一般是以短的(1~6 bp)基元组成的较低程度的串连重复序列，又称之为微卫星序列。目前SSR分子标记技术成功地运用于居群生物学研究、品种鉴定、物种的分类系统学等工作中，并作为构建遗传图谱的工具(Anthony et al., 2001; Ji et al., 2005a)。Ji等(2005a)通过构建基因组文库的方法成功地筛选到10个马尾松毛虫微卫星多态性位点，并设计了相应的引物，但只有部分引物可以应用于松毛虫属其他种松毛虫。本文参考Ji等(2005a)筛选出的10对引物，就其在油松毛虫种群中的应用进行了摸索，旨在利用SSR分子标记技术揭示平泉县部分油松毛虫亚居群的遗传结构，并针对林分类型和化学防治是否对油松毛虫居群遗传变异产生影响进行初步探讨，为该地区油松毛虫自然种群的联防联治提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 材料采集

油松毛虫5个亚居群均采自河北省承德市平泉县。平泉县地处燕山山脉末端，位于118°21′03″—119°15′34″E，40°24′0″—40°40′17″N，属中温带丘陵盆地半干旱区。气候属于温带大陆性季风型气候，冬季寒冷干燥，夏季高温多雨，年平均气温7.3 ℃，年降水量510 mm。在平泉县选择了具有代表性的5个不同类型的油松林，各林区的坡向位置、林分类型、林下植被、虫害防治情况等基本情况见表 1。各亚居群试虫均为2007年7月采集，在采集地随机采集虫蛹，室内羽化成虫后立即－20 ℃低温保存。

1.2 试验方法 1.2.1 基因组DNA的提取

各亚居群分别选取45头油松毛虫雌成虫，采用SDS方法提取基因组DNA(徐广等, 2000)，试验步骤如下:取油松毛虫成虫胸部肌肉，加入液氮充分研磨，添加提取液(100 mmol·L^-1 Tris-HCl pH8.0, 50 mmol·L^-1 EDTA, 150 mmol·L^-1 NaCl, 1%SDS)600 μL于研钵中，充分混匀后移入1.5 mL离心管中，60 ℃温育2 h，饱和酚抽提3次，氯仿抽提1次，2倍体积的无水乙醇沉淀，70%乙醇洗2次，自然风干后，加入100 μL TE溶解，加入RNAase酶消化，－20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 引物的筛选和PCR扩增条件的优化

参照文献(Ji et al., 2005a)，由上海生物工程技术服务公司合成10对引物，从中筛选出8对重复性好、多态性高的引物，其序列如表 2。SSR扩增反应条件为:总体积为25 μL，其中10×buffer 2.5 μL，Taq酶0.2 μL，dNTP (10 mmol·L^-1)2 μL，上游和下游引物(5 μg·μL^-1)各2 μL，DNA模板2 μL，去离子水加至25 μL。扩增程序为94 ℃预变性4 min，38次循环为94 ℃变性20 s、Tm退火30 s、72 ℃延伸15 s，最后72 ℃延伸2 min。扩增产物用7.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，以pBR322DNA/MspⅠ为分子质量标准，以照片形式对扩增结果进行记录。

1.3 结果记录及遗传参数分析

根据分子质量大小对扩增结果读带，以二倍体形式记录，从大到小依次记作A，B，C，……，用POPGENE-Version1.31软件(Yeh et al., 1999)进行数据处理和聚类运算，获得各位点的等位基因频率，并计算以下遗传参数:多态位点百分数(P); 平均每个位点的有效等位基因数(Ae); 平均每个位点的观测杂合度(Ho)和预期杂合度(He); Shannon information Index (I); 杂合性基因多样度比率(Fst); 居群每代迁移数(Nm)，基因流的测定由公式Nm=0.25(1-Fst)/Fst算得; 遗传一致度和遗传距离(D); 根据遗传距离用算术平均的不加权对群法(UPGMA)构建系统树。

2 结果与分析 2.1 油松毛虫5个亚居群的电泳结果及遗传学分析

用8对微卫星引物对平泉县5个油松毛虫天然亚居群基因组DNA进行扩增，扩增出的DNA条带长度在78~430 bp之间(表 2)，产生较高的多态性。在Ji等(2005a)的研究中，这8对引物均可以在马尾松毛虫和油松毛虫中获得较好的扩增，该结论在本文中也得到了验证，8对引物在5个油松毛虫亚居群共225个个体中都获得较好的效果。但本文中扩增片段的大小与上述文献中有所差异，文献中在马尾松毛虫扩增的片段范围为88~275 bp，而本文中扩增条带有400 bp以上的较大片段。其中引物SSR5的扩增结果无多态性，多态性最好的是引物SSR11，共检测到6个等位基因。从扩增产物的电泳图谱可以看出，油松毛虫5个天然亚居群间存在着遗传差异(图 1，2)。

从图 1和图 2中可以看出，有时SSR扩增产物会出现一些杂带和影子带，其主要原因是SSR引物在PCR扩增过程中会在模板链上发生滑动，加之非变性聚丙烯酰胺凝胶银染的分辨率较高，导致主带连同影子带一起显色。影子带会给带型统计带来一些干扰，但与主带相比都颜色较浅，所以在数据统计时应注意忽略掉影子带，以免产生人为误差。

2.2 油松毛虫5个亚居群的遗传多样性

从表 3可知，在油松毛虫5个亚居群的平均水平上，多态位点比率为80.00%(变幅为75.00%~87.50%)，A为2.625 0(变幅为2.500 0~3.000 0)，He为0.376 5(变幅为0.281 1~0.454 3)。数据表明Pop4即天然油松纯林油松毛虫亚居群杂合度最高，Pop2即油松、落叶松混交林亚居群杂合度最小。

从5个油松毛虫亚居群的总体水平来看，P=87.50%，A=3.125 0，He=0.474 7，Fst=0.215 9，Nm=0.908 1。从数据可知，承德市平泉县油松毛虫居群整体遗传多样性较高，总遗传多样性的21.59%来自于居群间的遗传变异，居群间已经发生了明显的遗传分化; 各亚居群间基因交流少。

2.3 油松毛虫5个亚居群的遗传距离及聚类分析

遗传距离是研究物种遗传多样性的基础，它反映了研究群体的系统进化，用以描述群体的遗传结构及种群间的差异。一般认为群体分化时间越短，遗传距离就越小。Nei氏标准遗传距离及遗传一致度见表 4。5个油松毛虫亚居群间的遗传一致度从0.657 3~0.932 2，遗传距离从0.070 3~0.419 7，遗传关系最近的是Pop1亚居群与Pop2亚居群，遗传关系最远的是Pop2亚居群与Pop3亚居群。从数据可以初步推测，Pop1亚居群与Pop2亚居群分化时间最短，而Pop2亚居群与Pop3亚居群分化时间则较长; 并且亚居群之间发生分化与林分类型和是否化防没有相关性。

3 结论与讨论 3.1 微卫星位点在松毛虫属昆虫中的保守性和变异性

仅从形态学和生态学方面进行比较，油松毛虫与马尾松毛虫基本相同，雌蛾前翅花纹和外生殖器也相似到难以识别的程度。但因2种松毛虫的主要寄主和分布区有所差异，在不同分布区的发生世代也不同，过去一直认为是独立的2个种。赵清山等(1992；1999)的杂交试验证实油松毛虫与马尾松毛虫可产生可育的杂交后代，应同属于一个种; 但考虑到油松毛虫及其主要寄主——油松在不同地理环境下的分布会造成一定遗传背景的差异，所以认为油松毛虫是马尾松毛虫的一个亚种Dendrolimus punctatus tabulaeformis。张爱兵等(2004)利用RAPD分子遗传标记技术也验证了马尾松毛虫和油松毛虫亲缘关系很近。Ji等(2005a)成功地筛选到10个马尾松毛虫微卫星多态性位点，并设计了相应的引物，在松毛虫属昆虫中进行了初步摸索，进一步验证了前人的结论。本研究使用Ji等(2005a)文献中筛选出的8对引物在油松毛虫中均可以得到较好的扩增，支持前人的论述。因为SSR分子标记中所使用的引物有较高的保守性，只能在亲缘关系较近的物种间应用，例如本研究证实Koshio等(2002)所筛选的3对舞毒蛾(Lymantria dispar)微卫星引物就不能成功应用于松毛虫属昆虫的种群遗传学研究中。

但微卫星分子标记技术在研究近缘种的遗传多样性中也存在一定的变异性:例如文献中在马尾松毛虫扩增的片段范围均为低于300 bp的小片段，而本文研究中相同的引物在油松毛虫种群中扩增条带有400 bp以上的较大片段，推测其原因应该是马尾松毛虫和油松毛虫种之间基因组序列的差异和所取样本的差异导致的。微卫星标记在鳞翅目昆虫种群遗传学应用不是很多，Zhang(2004)的研究发现在鳞翅目昆虫中基因组的微卫星侧翼序列高度保守是该种类昆虫微卫星丰富度较低的原因; Meglecz等(2007)通过对32种昆虫的微卫星序列的研究也证实不同物种之间微卫星位点的侧翼序列差异很大。如果按照常规的微卫星位点的筛选，需要耗费大量的时间和精力，参考研究材料的近缘种的相关文献来获得微卫星引物不失为快捷有效的手段。在今后的工作中应深入研究相关近缘种SSR文献中的引物信息，如棉铃虫(Helicoverpa armigera)、家蚕(Bombyx mori)、蝶类等，以期获得更有效的引物及更好的扩增结果(Li et al., 2005; Grasela et al., 2005; JI et al., 2005b)。

闫路娜等(2004)、吉亚杰(2004)研究发现样本大小与所观测到的每位点等位基因数、平均等位基因数及基因丰富度指数均呈显著正相关; 对大多数种群遗传学研究而言，30~50个个体是微卫星DNA分析所需要的最小样本量。本研究中每个天然亚居群均为随机采样，室内羽化后按雌雄性别分别冷冻，各居群均选取45头健康试虫进行分析。在前期试验中未发现因性别不同而造成的结果差异，闫路娜等(2004)在研究中也证实雌雄个体对种群遗传结构的贡献无显著差异，但为了试材一致，各居群均采用雌虫。

3.2 油松毛虫5个亚居群的遗传多样性及影响因素

利用SSR分子标记技术对油松毛虫5个亚居群进行遗传多样性研究，发现Pop4即天然油松纯林油松毛虫亚居群杂合度最高(0.454 3)，Pop2即油松、落叶松混交林亚居群杂合度最小(0.281 1)，该结果证明油松毛虫种群在不同林分类型、不同立地条件的林区内遗传多样性存在较大差异。王国红等(2005)研究发现马尾松纯林中松毛虫幼虫的发生量大，受害极为频繁; 马尾松针叶林、马尾松灌木林和马尾松阔叶林的马尾松毛虫为害程度均不大，保持林地内有虫不成灾的状态。许国莲等(2002)也证实云南松毛虫(Dendrolimus houi)虫源地林分特征为阳坡或半阴半阳坡、开阔度小、土壤综合肥力差、纯林; 有虫不成灾林分特征为阴坡、大开阔度、土壤综合肥力良好、混交林。Pop4亚居群为天然油松纯林，油松毛虫种群规模和虫口密度在5个亚居群中均是最大的，林区地处阳坡，林下植被较少; Pop2为油松、落叶松混交林，油松和落叶松各占半数，虫口密度较小，半阴坡。同时，从另一个角度分析，Pop4亚居群为常年苦参碱飞防区，推测该亚居群的油松毛虫种群在长时间的化学防治压力下已经产生了相应的遗传适应机制; 而Pop2亚居群因林区地形较隐蔽、松林规模较小，从未进行过化学防治，受人为干扰程度较小，基本等同于封山育林管理条件下的生态效应，林区生态系统稳定，所以该林区油松毛虫种群相对来说也处于较稳定的发展阶段。高宝嘉等(1992)的研究表明，封山育林中松毛虫不易猖獗成灾的原因主要是森林生物群落丰富，取食松毛虫的天敌种类和数量较多，从而抑制了松毛虫的为害; 而纯松林生物群落结构简单，松毛虫的食料充足，松毛虫容易猖獗成灾，从而形成松毛虫的发生基地。综合各亚居群的林分类型、立地条件和化防情况等几方面分析，天然油松纯林生物群落单一，在外界人为干扰和化学防治的双重压力下，油松毛虫亚居群已产生适应机制，居群内杂合度较高; 而油松、落叶松混交林地势偏僻，外界干扰影响小，亚居群种群数量较少，杂合度也偏小。油松毛虫在种群内亚居群水平上存在较大的变异，这种变异在某种程度上是对环境压力的敏感反应，从而在种群水平上提供适应环境的遗传物质基础。

3.3 油松毛虫5个亚居群的遗传分化

从种群遗传学和进化学角度去看，各种形式的隔离(自然屏障隔离、距离隔离等)的效果都会阻断或降低基因流，增强近交程度，也正是这种自然选择通过破坏种群的随机交配而加速了亚居群间的遗传分化。承德平泉县油松毛虫种群遗传结构总体水平来看，P=87.50%，A=3.125 0，He=0.474 7，Fst=0.215 9，Nm=0.908 1，可见种群内整体遗传多样性较高，亚居群间已经发生了明显的遗传分化。根据遗传距离数据初步推测，Pop1亚居群与Pop2亚居群分化时间最短，而Pop2亚居群与Pop3亚居群分化时间则较长。各亚居群间基因交流少，Nm仅为0.908 1。群体间基因流可以用群体每代迁移系数(Nm)来度量，若Nm＜1则表明居群间基因交流较少，无法有效抵消遗传漂变所引起的种群分化，遗传漂变就成为刻划群体遗传结构的主要因素(Slatkin, 1985；1987)。5个油松毛虫亚居群基因流较小，其原因首先应该与采集样地的地理位置和种群规模有关: Pop1、Pop2和Pop3 3个亚居群相邻较近，但分别以山坡相隔，且这3个松林规模都较小，油松毛虫种群数量也较小; Pop4和Pop5 2个油松毛虫种群规模较大，但与前3个亚居群相隔很远，有1 h的车程。平泉县山坡地森林覆盖率较高，但是近年来人为干扰(如化学防除、林地放牧等)造成油松毛虫栖地片断化，片断化的生境进一步加大各亚居群间的隔离程度，进而阻碍油松毛虫居群间的基因交流。再者，松毛虫无迁飞习性，在食料充足时很少发生迁飞，成虫飞翔力不高(侯陶谦, 1987)，也应该是其基因交流水平低的原因之一。生境分散、规模较小的居群较易导致居群结构发生遗传漂变，低水平的基因交流又无法削弱遗传漂变的影响，由此可见，可能会因遗传漂变作用进一步加大油松毛虫亚居群间的遗传分化程度。

昆虫的种群遗传特性决定了它在特定环境和群落中的生存繁衍，种群内个体间的遗传联系及其种群间的遗传分化研究可以反映种群内基因的分布状况，从而解决生态学需要阐明的根本问题——不同基因型对不同生态环境的适应。松毛虫属昆虫在我国林业害虫防治中占有重要地位，目前，人类的经济生活已对该物种生物多样性造成一定影响，但在此过程中的生态学和遗传学机制我们仍旧不是很清楚。利用微卫星分子标记检测和描述油松毛虫地理种群的遗传结构及变异状况，并分析环境条件、食物条件等生态因素在物种形成与分化过程中的影响机制，对保护物种多样性及合理防治油松毛虫一定会起到十分重要的作用。