万寿菊(Tagetes erecta)为菊科万寿菊属植物, 广泛分布于世界各地。除作为一般观赏花卉外, 由于其根内含有特殊的活性物质而备受重视, 成为从2 400种已记载的控害植物中挑选出来的43种广谱控害植物之一, 被誉为"控害植物精华"(王新国等, 2002)。万寿菊的根提取物对小菜蛾(Plutella xylostelle)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、烟草天蛾(Manduca sexta)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、埃及库蚊(A.aegypti)、中华按蚊(Anopheles sinensis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、黄粉甲(Tenebrio molitor)、山楂叶螨(Tetranychus viennensis)等有较好的毒杀活性, 并且以光活化活性为主(Morallo -Rejesus, 1987; 赵善欢等, 1997; 乐海洋等, 1998; 王鸿雷等, 2003)。

枣尺蠖(Chihuo zao)属鳞翅目、尺蛾科, 广泛分布于我国晋、冀、鲁、豫等枣区, 其幼虫取食枣叶及枣花, 常造成红枣的减产甚至绝收。

研究表明:以万寿菊根为材料, 以氯仿为溶剂, 用索氏法提取的提取物对枣尺蠖幼虫的生物活性最高(刘贤谦等, 2002)。本研究用万寿菊根氯仿提取物处理枣尺蠖幼虫, 在光照和非光照条件下, 对其3种保护酶进行了测定, 旨在探明该提取物对枣尺蠖幼虫的特殊作用方式和更深层次的光化学活性。

1 材料与方法 1.1 植物材料及活性物质提取方法

参考史志诚等(1997)的方法。采集新鲜的万寿菊根洗净阴干后, 放入恒温箱内, 在45℃以下鼓风烘干, 然后用电动粉碎机粉碎过40目筛。准确称取5 g根粉, 用滤纸包好置于索氏提取器中, 以100 mL氯仿为溶剂, 连续回流8 h, 将所得提取液趁热过滤, 减压浓缩至浸膏状, 取一定量的提取物, 用丙酮溶解稀释至所需浓度, 作为处理药剂。

1.2 枣尺蠖幼虫的饲养

从祁县东观枣园采集新羽化的枣尺蠖成虫, 置于室内养虫笼中让其自然交配产卵, 待幼虫孵化后, 在温度(25 ±1)℃, 相对湿度85%±15%, 光照L:D=16:8条件下, 采集新鲜枣叶饲养, 从中挑选生长发育正常, 整齐一致的3龄幼虫供试。

1.3 处理方式

根据生物测定结果, 选用万寿菊根氯仿索氏法提取物(TPC, tagetes patula contents)10 mg· mL^-1作为处理药剂。挑选适量3龄枣尺蠖幼虫, 饥饿4 h, 然后随机分为光照组和非光照组, 并且分别设立对照。采用浸渍叶碟法, 将洗净的新鲜枣叶用镊子夹住, 放入配置好的药液中, 对照用同浓度的丙酮代替, 浸渍大约10 s, 然后取出摆放在滤纸上晾干。光照组于幼虫取食2 h后, 用DRZ -日光色镝灯照光3 h, 然后放入养虫室内饲养, 按一定时间间隔取适量幼虫供试。

1.4 酶源制备

取试虫8~10头, 按每头加入3 mL预冷的1%聚乙烯吡咯烷酮(用pH7.0的50 mmol·L^-1磷酸缓冲液配制), 冰浴中研磨提取, 匀浆置于2℃, 10 000 r·min^-1离心20 min, 上清液即为酶液, 4℃贮存备用。

1.5 保护酶活性的测定

参照李周直等(1994)、蒋志胜等(2000;2003)的方法。

超氧化物歧化酶(SOD)活性测定:3 mL反应液含50 mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH=7.0), 13 mmol·L^-1的蛋氨酸, 75 μmol·L^-1的氮蓝四唑(NBT), 0.1 mmol·L^-1乙二胺四乙酸(EDTA)和50 μL酶液, 最后加入20 μmol·L^-1的核黄素。置于4 000~6 000 lx日光下进行光反应, 反应温度25℃, 反应时间20 min, 用黑暗终止反应, 立即在560 nm下比色。一个酶活力单位相当于3 mL反应液达到50%抑制时所需的酶量。

过氧化氢酶(CAT)活性测定:5 mL反应液含50 mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH=7.0), 8 mmol·L^-1的H₂O, 和100 μL酶液, 在30℃下准确反应1 min, 加入10%的H₂SO₄终止反应。用2.0 mmol·L^-1的KMnO₄滴定剩余的H₂O₂, 根据H₂O₂的消失量计算CAT活性。

过氧化物酶(POD)活性测定:3 mL反应液含100 mmol·L^-1磷酸缓冲液(pH=6.0), 30 mmol·L^-1的愈创木酚, 26 mmol·L^-1的H₂O₂和100 μL酶液, 室温下反应5 min, 立即在470 nm下比色, 以每分钟光密度的变化值表示酶活性的大小, 即以ΔOD₄₇₀·min^-1mg^-1蛋白质表示。

2 结果与分析 2.1 TPC处理后试虫体内氧化物歧化酶(SOD)活性的变化

图 1表明:在暗处理下, 对照组试虫的SOD活性变化不大, 维持在35(U·mg^-1 protein)的相对稳定水平。但对照组经过光照处理后, 在1~2 h内, 试虫体内SOD活性明显高于对照, 2~3 h内迅速上升, 达到高峰值。4 h后逐渐下降并稳定在暗处理的对照水平, 说明光照能提高试虫体内SOD的活性。TPC药剂处理组, 在无光照条件下, 在1~2 h内其SOD活性略高于对照, 并呈上升趋势, 到3 h时升至最大值, 随后又开始下降, 并在4 h后SOD活性低于对照; 而在光照条件下, SOD活性在1 h时最高, 以后逐渐下降, 3 h时降到最低, 4 h时虽又有所恢复, 但以后始终低于对照。表明药剂TPC在光照条件下对试虫的SOD活性有抑制作用, 在3 h内, 随光照时间的延长而抑制作用增强。

由表 1看出:试虫在光照1 h体内的SOD活性比对照高2.55, 光照2 h比对照高2.65, 光照3 h比对照高4.33, 活性差值达到最大。在停止光照后1 h即4 h活性比对照高1.45, 而在5~7 h下降到对照水平, 说明光照能显著提高试虫的SOD活性, 并且随着光照时间的延长而SOD活性逐渐增强, 并且在停止光照后SOD活性逐渐恢复到对照水平。无光照条件下, 经TPC处理后, 在1~7 h, SOD活性始终高于对照, 并且在3 h时SOD活性达到最大, 比对照高5.85。说明试虫取食药剂后, 体内产生自由基等有毒物质, 为了避免或减轻这些有毒物质所造成的伤害, 试虫提高了SOD活性来清除这些有毒物质。在光照条件下, TPC处理组在光照1h时, 试虫体内的SOD活性比对照高2.00, 说明TPC已经对试虫起作用, 使SOD的活性提高。但是在光照2h时, SOD活性比对照低3.98, 光照3 h时, SOD活性和对照差值达到最大, 即比对照低10.62, 在3 h中止光照后, SOD活性虽然在4~7 h略有上升但是一直低于对照。说明药剂TPC处理在光照1 h后对SOD活性才有明显抑制作用, 随着光照时间的延长而抑制作用逐渐增强, 在光照结束时, 抑制作用达到最大; 在光照中止后, TPC对SOD活性仍有明显抑制作用。

2.2 TPC处理后试虫体内过氧化物酶(POD)活性变化

图 2表明:在7 h内, 对照组在无光照条件下试虫体内的POD活性很稳定, 在光照条件下, 在1~4 h内POD活性显著高于无光对照组, 3 h中止光照后, 4 h POD下降, 并保持在无光照的水平, 说明光照对POD活性有显著的增强作用。用药剂TPC处理后, 无论有无光照, 其POD活性均表现出明显的增强, 其变化的趋势因药剂和处理时间的不同而有所不同。无光照组在1~ 7 h范围内, POD活性均显著高于对照组; 而光照组在1 h时POD的活性最高, 以后急剧下降, 在4 h时降到最低, 接近于对照, 随后又逐渐上升。说明在光照条件下TPC对试虫的POD活性有明显的抑制作用, 随光照时间的延长, 抑制作用增强, 在光照后1、4 h时抑制作用最强。

各处理与对照之间POD活性的差值如表 2所示。试虫在光照1 h时体内的POD活性比对照高0.043, 光照2 h时比对照高0.066, 光照3 h比对照高0.096, 活性差值达到最大。在停止光照后1 h即4 h的活性比对照高0.038, 而在5~7 h下降到对照水平。说明光照能显著增加POD活性, 并且随着光照时间的延长而试虫体内POD的活性逐渐增强。并且在停止光照后POD活性能逐渐恢复到对照水平。在无光照条件下, TPC处理组在1~7 h内, SOD活性始终明显高于对照, POD活性平均是对照的1.28倍, 并且在2 h时POD活性比对照高1.4倍。说明试虫取食药剂后, 体内产生自由基等有毒物质, 通过体内提高POD活性来清除这些有毒物质。在光照条件下, TPC处理组在光照1 h和2 h时, 试虫体内的POD活性比对照高; 但是光照3 h, POD活性比对照低0.02, 光照4 h, SOD活性和对照差值达到最大, 即比对照低0.023;, 在5~7 h POD活性有一定上升, 并且明显高于对照。说明药剂TPC在光照条件下, 光照1 h后对POD活性有明显抑制作用, 并且在光照结束1 h时, 抑制作用达到最大, 说明在光照条件下, 药剂TPC对POD活性有明显抑制作用, 抑制作用发生在光照后1 h, 并且在光照结束后抑制作用逐渐降低。

2.3 TPC对试虫体内过氧化氢酶(CAT)活性的影响

图 3表明:在7 h范围内, 无光对照组CAT活性较低, 而且非常稳定。光照对照组在4 h以前试虫的CAT活性增强, 4 h后恢复到无光对照的水平, 说明光照能增强试虫的CAT活性。TPC药剂处理后, 在第1 h时, 无论有无光照, 其CAT活性均明显增强, 但是随后的变化趋势因药剂和处理时间不同而有所不同。无光照组, 在随后的时间里CAT活性始终显著高于对照, 而光照组CAT活性一直处于下降, 并在4 h时降到最低, 低于对照, 4 h后又上升, 到5 h后又明显高于对照并保持稳定状态。表明TPC药剂处理在光照条件下对试虫CAT活性有显著的抑制作用, 4 h时抑制作用最强。

从表 3可以看出, 光照试虫在光照1 h时, 体内的CAT活性比对照高1.00, 光照2 h时比对照高1.16, 光照3 h时, 活性差值达到最大比对照高2.12。在停止光照后1 h即4 h时, 活性仅比对照高0.03, 此后, 都和对照相差不大, 说明光照能显著提高CAT活性, 并且随着光照时间的延长而提高幅度增大, 并且在停止光照后CAT活性能迅速恢复到对照水平。无光照条件下, 药剂TPC处理组, 在1-7 h, CAT活性均显著高于对照, 平均高于对照2.9个酶活力单位, 并且在3 h时CAT活性和对照的差值达到最大, 即比对照高4.3个酶活力单位。说明试虫取食药剂后, 通过体内提高CAT活性来清除有毒物质。在光照条件下, TPC处理组, 光照1 h时试虫体内的CAT活性高于对照3.9个酶活力单位, 说明药剂TPC已经对试虫起作用, 使试虫体内的CAT显著增高, 而光对CAT的抑制作用还未显现出来。在光照2 h时光对CAT的抑制作用才明显显示出来。在光照3 h和结束光照后1 h, 处理组试虫CAT活性分别比对照低0.72和0.68, 在5~7 h CAT活性有一定上升, 并且略高于对照。说明药剂TPC在光照1 h后对CAT活性有明显抑制作用, 并且在光照结束1 h时, 抑制作用达到最强。

3 结论与讨论

超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶是昆虫保护酶系统中的主要酶系。SOD能清除O₂, 防止形成H₂O₂, H₂O₂能与O₂形成毒性更强的HO对细胞形成伤害; 过氧化氢酶和过氧化物酶具有分解H₂O₂的作用(方允中等, 1989)。在正常情况下, 细胞内自由基的产生与清除是在SOD、POD及CAT 3种酶协调一致, 动态平衡状态下进行的, 从而防止了因自由基积累而造成毒害。一旦这种平衡受到破坏, 就可能产生伤害作用。

万寿菊根氯仿提取物TPC对枣尺蠖保护酶系统的影响在有光与无光条件下截然不同。在无光照条件下, 过氧化氢酶和过氧化物酶活性始终明显高于对照, 在1~3 h时超氧化物歧化酶活性也高于对照, 说明TPC药剂进入试虫体内产生自由基等有毒物质, 试虫通过这3种酶活力的提高来积极消除这些有毒物质, 保护体内细胞器不受侵害, 从而保证正常的生理功能。在光照条件下, TPC对超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶组成的保护酶系统的活性产生显著的抑制作用。在光照3 h时, 对SOD的抑制作用最强, 在4 h时对过氧化氢酶和过氧化物酶的抑制作用最强, 这和光照组试虫大量死亡的时间, 即在光照结束后1 h内的时间相吻合, 说明在光照条件下, TPC对这3种保护酶的抑抑制是造成试虫大量死亡的主要原因之一。

由于SOD、POD、CAT活性受到抑制, 它们之间的动态平衡状态遭到破坏, 使得试虫体内产生的大量的自由基等有毒物质无法及时清除, 同时TPC和光照能增加自由基等有毒物质的浓度, 从而加重了对试虫细胞器的侵害, 导致正常的生理功能失调, 从而造成试虫的死亡。这和蒋志胜等(2003)的研究结论相一致。