近几年来, 植物自交不亲和性(self-incompatibility:SI)的分子机理研究取得了很大进展(Sassa et al., 1996; 张绍铃等, 2001; Wang et al., 2003), 一般SI被分为孢子体型自交不亲和性(sporophytic SI:SSI)和配子体型自交不亲和性(gametophytic SI:GSI)两大类。目前研究发现沙田柚(Citrus grandis)、杏(Armeniaca vulgaris)、扁桃(Amygdalus communis)、苹果(Malus domestica)、梨(Pyrus pyrifolia)、甜樱桃(Cerasus avium)等果树都属于配子体自交不亲和类型, 并在扁桃(Tamura et al., 2000)、甜樱桃(Sonneveld et al., 2001; Wiersma et al., 2001; Wunsch et al., 2004)、日本梨(Pyrus serotina)(Norioka et al., 2001)、杏(齐洁等, 2003; Romero et al., 2004)、苹果(Sanchez et al., 1999)及梅(Armeniaca mume)(Entani et al., 2003)等果树中已经克隆出S-RNase基因, 另外在梅等树种上还克隆出了花粉S-基因(SFB)(Entani et al., 2003)。在比较分析它们的序列后发现, 蔷薇科(Rosaceae)果树与茄科(Solanaceae)植物的S-RNase基因都有5个保守区, 分别为C1、C2、C3、RC4、C5, 所不同的是, 蔷薇科果树S-RNase基因只有1个高变区, 而茄科植物有HVa和HVb 2个高变区。进一步比较DNA与cDNA序列, 发现在蔷薇科果树中内含子的表现并不一致, 日本梨、西洋梨(Pyrus communis)及部分扁桃(Tamura et al., 2000)只在高变区中有1段内含子, 而甜樱桃在高变区及信号肽与成熟蛋白编码区之间各有1段内含子(Wunsch et al., 2004)。

杏是我国三北地区生态经济防护林建设的首选树种, 但自交不亲和性导致的坐果率低、稳产性差是限制其发展的重要因素之一。深入研究杏自交不亲和性的遗传及分子机理, 是培育自交亲和性品种的重要基础。目前已经从杏中检测到7个(S1~S7)与杏自交不亲和性相关的RNA酶带(Albuquerque et al., 2002), 克隆出6个S-RNase基因(齐洁等, 2003; Romero et al., 2004)。在已有的工作基础上, 本课题组近几年来以自交亲和的`凯特'杏(A.vulgaris cv.Katy)为母本, 以品质优良自交不亲和的`新世纪'杏(A.vulgaris cv.Xinshiji)(陈学森等, 2001; 郑洲等, 2004)为父本进行有性杂交并胚培养, 构建了杂种一代分离群体, 从中选育出自交亲和、品质优良的`山农凯新1号'新品种(陈学森等, 2005); 吴燕等(2005)进一步研究发现, 杏的自交亲和性是一个非常复杂的问题, 不仅与S基因型有关, 可能还受转录或翻译水平调控因子及其他修饰基因的影响, 值得进一步研究。为此, 本文检测并克隆了`凯特'及`新世纪'杏的S-RNase基因, 并进行了基因表达及序列比较研究, 旨在为深入理解杏品种自交亲和性强度差异的分子机理提供依据和参考。

试验于2003 -2004年在山东农业大学果树生物学实验室及泰安市横岭果树育种基地进行, 试验地为沙壤土, 立地条件及管理措施一致。试材包括近几年从美国引进的自交亲和杏品种`凯特'和本课题组选育的自交不亲和杏品种`新世纪'。

1) DNA的提取及S-RNase基因特异扩增  取`凯特'、`新世纪'杏嫩叶, 采用齐洁等(2003)改良CTAB法(2%CTAB, 100 mmol·L^-1 Tris-HCl pH8.0, 20 mmol·L^-1 EDTA pH8.0, 1.4 mol·L^-1 NaCl, 2%PVP, 1%巯基乙醇), 提取总DNA, 溶解于1 ×TE溶液中。S-RNase基因特异引物是, AS1 Ⅱ:5'-TAT TTT CAA TTT GTG CAA CAA TGG -3', AmyC5 R:5'-CAA AAT ACC ACT TCA TGT AAC AAC -3'(Tamura et al., 2000), 由上海Sangon公司合成。用25 μL PCR反应体系, 含10 × PCR Buffer 2.5 μL, 3.0 mmol·L^-1 MgCl₂, 0.2 mmol·L^-1 dNTPs, 各引物0.2 μmol·L^-1, 20~50 ng模板, Taq酶1.25 U, 所用程序为94℃预变性5 min; 94℃变性45 s; 46℃退火45 s, 72℃, 120 s, 35个循环后72℃延伸10 min。反应结束后, 用1.2%的琼脂糖凝胶电泳45 min。

2) 总RNA的提取及S-RNase基因的RT-PCR反应  取`凯特'、`新世纪'杏气球期花, 剥取花柱, 称量0.5g, 置于离心管中, 先在液氮中快速冷冻, 后置于-70℃冰箱中保存用于RNA的提取。提取时采用上海Sangon公司的Trizol提取液, 按说明书操作。所用试剂器皿均进行无RNase处理。提取的RNA用无RNase的双蒸水溶解, 后置于-70℃冰箱备用。反转录酶采用AMV RT(TAKARA公司产品), cDNA合成的引物采用B26, 序列如下:5'-GAC TCG AGT CGA CAT CGA dT(17)-3', 由上海Sangon公司合成。反转录(cDNA合成)反应42℃进行, 按说明书操作。5 μL反转录产物用于下一步S-RNase基因的特异扩增, PCR反应体系、程序同上。

3) S-RNase基因特异片段的克隆及测序  扩增出的DNA和cDNA特异片段经纯化连接到pGEM-T easy Vector(Promega公司产品)中, 转化到感受态DH5α(由山东农业大学作物重点实验室张宪省教授赠)中克隆, 同一PCR产物至少挑10个单菌落进行目标带的检测, 至少选取5个含目标带的单菌落双向测序, 由上海Sangon公司用ABI PRISM 377 -96测序仪测定。本文发表的序列都是经过5个以上检测报告矫正后的结果。

4) S-RNase基因特异DNA和cDNA序列的分析  从GenBank、EMBL、DDBJ、PDB数据库中进行同源性搜索, 用DNAMAN软件进行DNA和cDNA序列分析, 依据推导的氨基酸序列用DNAStar5.01构建蔷薇科梅亚科(Prunoideae)果树S-RNase基因的系统进化树。

图 1显示, 经过S-RNase基因的特异引物扩增后, 自交亲和品种`凯特'杏叶片总DNA中检测到1条带, 自交不亲和品种`新世纪'中检测出2条带, 经克隆测序显示3个DNA片段分别为927 bp(来自`凯特'), 992 bp和583 bp(来自`新世纪')。从GenBank中megBlastn, 显示与这3个片段核苷酸序列同源的前50名基因都是蔷薇科梅亚科的S-RNase基因。与927 bp相似性最高的是甜樱桃的AJ635272, 有343 bp的片段相似性为88.05%;与992 bp相似性最高的是杏的AY587561, 有372 bp的片段相似性达90.86%;与583 bp相似性最高的是李(Prunus salicina)的AY781290, 有369 bp的片段相似性达97.02%。进一步分析显示出所有相似的片段都位于该类基因保守的外显子区, 表明本文克隆的这3个基因是新的S-RNase基因, 暂时命名为P.a S8 (来自`凯特'), P.a S9与P.a S10 (来自`新世纪'), 已经在GenBank中注册, 注册号分别为AY884212、AY853594、AY846872。

图 1 `凯特`与`新世纪'杏S-RNase基因扩增图谱 Fig. 1 S-allele-specific PCR of `Katy' and `Xinshiji' M:Marker(DL 2000);K:`凯特' `Katy'; X:`新世纪' `Xinshiji'.

提取气球期花柱总RNA, 用相同引物经RT-PCR特异扩增后, 2品种中也检测到3条带, 如图 2所示, 均在500 bp左右。经克隆测序分别为521 bp, 521 bp和479bp, 从GenBank数据库中同源性搜索证实3个片段都与梅亚科S-RNase基因高度相似, 用DNAMAN软件分析3条RT-PCR片段与DNA特异扩增片段, 证实确实为3个S-RNase基因片段相应部分的外显子, 说明这3个S基因在气球期花柱中都表达了。

图 2 `凯特`与`新世纪'杏S-RNase基因RT-PCR图谱 Fig. 2 RT-PCR of `Katy' and `Xinshiji' M:marker(DL 2000);K:`凯特' `Katy'; X:`新世纪' `Xinshiji'.

比较这3个基因片段的DNA和相应cDNA序列(由于序列已经在GenBank上登录, 在此就没有列出), 可看到, 在C1与C5之间, 3个基因都只有1个内含子, P.a S8、P.a S9、P.a S10的内含子大小分别为406 bp、471 bp、104 bp, 都位于C2与C3之间的RHV区, 其内含子的左端均为GT, 右端均为AG, 而且富含AT碱基(66.3%~73.3%), 符合真核生物所有编码蛋白质的核结构基因内含子的规律。3个基因在DNA水平上相似性大于50%, P.a S 8与P.a S9相似性较低为50.4%, P.a S9与P.a S10相似性较高为85.5%;3个基因在cDNA水平上相似率在83.1%~86.5%, P.a S 8与P.a S9 cDNA核苷酸序列相似性为86.5%。根据核苷酸序列推导的氨基酸序列在GenBank中搜索梅亚科S-RNase基因氨基酸序列构建系统进化树, 本研究克隆得到的3个S-RNase基因在系统进化树中聚在一簇, 但与齐洁等(2003)克隆得到的PA2b-S-RNase基因亲缘关系较远, 不在同一簇; 而且樱桃、杏、梅、扁桃、李等多个种间并没有明显地表现出种内相似性高于种间的相似性, 说明S-RNase基因的进化可能与梅亚科植物种的系统发育不同步。

采用AS1 Ⅱ、Army C5R引物, 检测出`凯特'、`新世纪'杏中S-RNase基因, 并初步证实检测出的基因在气球期花柱中被表达。该引物比以前报道(齐洁等, 2003; 吴燕等, 2005)的蔷薇科S-RNase基因C2与RC4区的特异引物, Pru C2与Pru C4R, 效果明显好, 从序列分析发现`凯特'的P.a S8与`新世纪'的P.a S9在RC4区与已经发表的保守序列存在5个碱基的不同, Pru C4R引物序列为5'-CGCTTCAATCGTACCACATCC -3', 而P.a S 8、P.a S 9的相应序列为5'-CGCTTCAATCGTACCAAGTGC -3', 即后面5个碱基不同, 因此本研究认为这可能是因为RC4区域在杏上不是很保守, Pru C4R可能并不是检测杏各品种S-RNase基因的最佳特异引物。

一般来说在蔷薇科果树上, 很多研究表明, 用基因组DNA进行S等位基因专一性PCR扩增或RNase等电聚焦凝胶电泳法, 检测到二倍体植物的S基因型呈现2条带, 但Burgos等(1998)在杏的花柱蛋白非平衡pH梯度等电聚焦试验中发现, `Gitano' (自交不亲和)只有1条S5蛋白带; Tao等(2000)在梅上用Pru C2、Pru C4R为引物, 在`Baigo' (自交不亲和)和`Kensaki' (自交亲和)上只扩增出1条带。本研究在`凯特'中也只扩增出1条带, 同前人一样目前尚不能很好地解释该现象, 其具体原因有待进一步研究。

`凯特'、`新世纪' 3个S-RNase基因DNA、RNA(cDNA)片段序列显示出P.a S8、P.a S 9、P.a S10在C1~C5保守区间, 内含子长度、碱基排列顺序均有差异, 且在高变区(RHV)和RC4保守区也有明显的差异。据已有研究认为S-RNase基因的高变区(RHV)在自交不亲和反应中可能参与花粉S -蛋白的专一性识别(Sassa et al., 1996; Sonneveld et al., 2001; Wunsch et al., 2004), 而位于高变区内的内含子虽然没有编码形成S-RNase基因的氨基酸, 但是在雌蕊与花粉S -基因的识别及亲和反应中是否为多余的"垃圾序列", 或者具有某些尚未阐明的功能?有研究报道在马铃薯(Solanum tuberosum)蔗糖合成酶Sus4上的转基因试验发现内含子对基因表达的影响(Fu et al., 1995), 谢先芝等(2002)认为内含子序列的有无、内含子大小以及内含子在信使RNA转录后的剪切效率都会影响基因的表达效率。因此这些序列的差异, 是否最终会产生表现型差异, 对于进一步认识遗传来源相同的`凯特'与`新世纪'杂种后代, 在基因型一致的基础上, 为什么有的表现自交亲和, 有的表现为自交不亲和都有积极意义。