病害是导致农林业减产主要原因之一。人们一直努力通过各种育种方法进行抗病品种的选育，基因工程是其中有效的途径之一。国内外科学家已利用转基因技术在植物抗病基因工程方面进行了不少有益的研究，获得了许多转基因抗病植物。但由于植物在生长过程中会受到多种病害(细菌、真菌、病毒和线虫等)的袭击，单独转入某一个抗病基因往往具有一定的局限性。为了提高转基因植物的广谱抗病性和持久性，更好地抵御不同病害，就需要同时转入一个以上的、广谱抗性的抗病基因，因此多基因载体的构建和遗传转化的研究日渐增多。

兔防御素是迄今为止表现出抗微生物谱最广的防御素(defensin)之一，对革兰氏阴性菌、阳性菌、分枝杆菌、真菌、被膜病毒、HIV病毒在不同程度上都有抑制作用，还能杀灭鼠肿瘤等恶性细胞(Lehrer et al., 1993)。天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protien, GAFP)位于天麻次生块茎的表皮和皮层，对天麻次生块茎阻抑蜜环菌侵染有关，离体抑菌实验表明天麻抗真菌蛋白对多种真菌均有抑菌活性(胡忠等，1988)。因此本研究将兔防御素基因NP1和天麻抗真菌蛋白基因GAFP构建在一个载体上，转化烟草，以期提高转基因烟草对多种病害的抗性，并且探索一条有效的多基因转化途径。

1 材料和方法 1.1 材料和试剂

大肠杆菌(Escheriachia coli)DH5α，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)工程菌株LBA4404；质粒pBin35SNP-1, pBin35SGAFP, pDM302-Fu, pGEM-7zf均由中国科学院遗传与发育生物研究所孙勇如研究员提供；

以烟草无菌苗为实验材料，分化培养基：MS+6-BA2 mg·L^-1+IAA0.5 mg·L^-1；筛选培养基：MS+6-BA2 mg·L^-1+IAA0.5 mg·L^-1+Kan 50 mg·L^-1+cef 50 mg·L^-1；生根培养基：1/2MS+Kan 50 mg·L^-1+cef 50 mg·L^-1;

瑞氏木霉(Trichoderma reesei)由南京林业大学化工学院余世袁教授提供；松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)由南京林业大学森环学院韩正敏教授提供。

1.2 双价抗病基因植物表达载体pBin35SGAFP-NPI的构建

采用常规DNA重组技术，涉及质粒提取、转化酶切、片段回收、连接和重组子的鉴定等。具体构建路线如图 1所示：通过HindⅢ+EcoRⅠ双酶切将基因表达盒“35S-NP1-NOS终止子"切下，连接与用同样的双酶切载体pDM302-FU上，即中间载体pDM302-FU-35SNP1，在HindⅢ前增加了XhoI位点；用XhoI+EcoRI分别双酶切中间载体pGEM-7zf和DM302-FU-35SNP1，连接为第二个中间载体pGEM-NP1b；pGEM-NP1b的基因表达盒“35S-NP1-Nos终止子"两端均具有HindⅢ位点，采用HindⅢ单酶切将其切下，连接于含另一抗病基因植物表达载体pBin35SGAFP的HindⅢ处，构建为双价抗病基因表达载体pBin35SGAFP-NP上，两个基因具有各自的CaMV35S启动子和Nos终止子。

1.3 烟草遗传转化

参照de Block(1988)的方法，将pBin35SGAFP-NP1/LAB4404培养至OD₆₀₀≈1.0, 离心，重悬，取组培3周龄的无菌烟草叶片，去中脉，剪成0.5~1.0 cm²的叶盘浸染于菌液中10 min，用无菌滤纸吸干多余菌液，移至分化培养基25 ℃暗培养48 h，再将叶片转入筛选培养基继续暗培养约1周，待叶盘边缘长出淡黄色愈伤组织后移到光下培养。每3周继代1次。当芽长至1 cm左右，转至生根培养基诱导生根，生根后移栽至25 ℃左右的温室中。

1.4 转基因烟草的PCR分析

用CTAB法提取具有Kan抗性的部分转基因植株和阴性植株的总DNA。NP1双引物分别为1) GTG TAG GAT CCA TGG TGG TCT GTG CGT GCA GAC G，2) GGG AGA GCT CAG TAG TCC AAA CAT GT；GAFP双引物分别为1) ACG TCT AGA AGG GAT CGG TTG AAT，2) GAT CTC GAG GCC AGA AGC CGC CGC TGT。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环后再延伸10 min。

1.5 PCR-Southern分析

提取pBin35SGAFP-NP1质粒，用XbaⅠ和SacⅠ进行双酶切，电泳并回收相应目的基因片段作为待标记的探针，GAFP约400 bp，NP1约200 bp。采用由Roche公司生产的DIG-Labeiling试剂盒进行探针标记。以非转化植株和PCR阳性植株总DNA为模版，对NP1和GAFP两个基因同时进行PCR扩增，电泳，转膜。然后采用该试剂盒杂交和显影分析。

1.6 转基因植株的抑菌实验

本实验采用琼脂糖孔穴扩散法(方宏筠等，1999)，分别取非转化植株和PCR检测为阳性植株的幼叶于无菌研钵中捣碎，按照1 g·mL^-1加入无菌磷酸钠缓冲液(pH6.4)，研成匀浆。将匀浆转入无菌离心管中，4 ℃抽提过夜，10 000 r·min^-1 4 ℃离心20 min，取上清供测试用。

将农杆菌工程菌株LBA4404培养至对数期，4 000 r·min^-1室温离心10 min，收集菌体，用无菌磷酸钠缓冲液洗涤2次。取100 μL菌悬液, 加入温度约40 ℃的LB固体培养基中, 充分混匀, 铺平板。待培养基冷却凝固后，用无菌枪头培养基平板上打孔，取出琼脂块，分别加入阴性对照和待测样品200 μL，28 ℃温箱内培养，24~36 h后观察抑菌结果。

将瑞氏木霉和松枯梢病菌分别接种于马铃薯培养基平板上，30 ℃培养至菌丝萌发。用无菌枪头分别在菌丝处和空白马铃薯培养基平板圆心位置打孔，取出空白琼脂块，将有菌丝的琼脂块填入其中，30 ℃培养至菌丝直径约为3 cm。再在接种孔左右两边打孔，取出琼脂块，分别加入阴性对照和待测样品200 μL，30 ℃温箱内培养，24~36 h后观察抑菌结果。

2 结果与分析 2.1 双价抗病基因载体pBin35SGAFP-NP1的鉴定

“35S-NP1-Nos"基因表达盒(长1.3 kb)是通过HindⅢ单酶切，插入pBin35SGAFP的HindⅢ处连接而成的。随机挑取转化子培养，提取质粒，并进行HindⅢ酶切鉴定，切下了1.3kb的片段(图 2)，说明双价抗病基因载体pBin35SGAFP-NP1构建完成。最后，将构建好的表达载体pBin35SNPIGAFP-NP1通过液氮冻融法转入根癌农杆菌工程菌株LBA4404中。

2.2 Kan抗性植株的获得

将烟草叶片转入筛选培养基约2周后，叶片膨大，周围开始皱缩，并有淡黄色愈伤组织生成，而阳性对照愈伤长势更好，有芽点产生；阴性对照仅仅叶片有些膨大。此时将它们移到光下(16 h·d^-1)，再过两周转化叶片长出Kan抗性苗，阳性对照几乎没有分化出抗性芽。将芽移入含Kan 50 mg·L^-1的生根培养基上，大部分在10 d左右都能正常生根。

2.3 Kan抗性植株的PCR检测

选取20株生长状态较好的Kan抗性苗和1株非转基因植株，用CTAB法提取植物总DNA，GAFP基因采用双引物进行PCR扩增。结果表明，转基因植株同阳性对照(质粒pBin35SGAFP-NP1)一样，在约200bp(NP1基因片段)和400bp(GAFP基因片段)处各有一条特征带，而在阴性对照的泳道上却没有该特征带(图 3)。

2.4 PCR-Southern杂交分析

为进一步验证NP1基因和GAFP基因是否已整合到植物基因组中，对PCR阳性植株进行了PCR-Southern杂交。图 4中第一泳道为pBin35SGAFP-NP1质粒的双基因PCR扩增产物，第二泳道为非转化植株的PCR产物，第3至第12泳道为Kan抗性植株PCR产物。从图 4可以看出，在筛选培养基上能正常分化，生长健壮的Kan抗性植株，均产生两条带分子量与阳性对照相同，即约200bp和400bp的杂交带。上述结果表明NP1基因和GAFP基因已整合到烟草基因组中。

2.5 PCR阳性植株抑菌作用检测

琼脂糖孔穴扩散实验结果证明：转基因烟草具有一定的抑制根癌农杆菌、瑞氏木霉和松枯梢病菌的活性(图 5)。说明NP1基因和GAFP基因已经整合到烟草基因组中，并且得到有效的表达。

3 讨论

利用多基因同时改良植物性状是目前基因工程的研究热点之一(Stanton, 1998)。Hedi(1996)通过基因枪法将12个质粒转入大豆；冯道荣等(1999)将β-1, 3-葡聚糖酶基因和碱性几丁质酶基因同时转入水稻，证明转双抗真菌基因的水稻植株同时提高了对稻瘟病和枯纹病菌的抗性。但将多个基因构建在不同的表达载体上依次或同时转入同一受体，不仅耗时费力，而且得到多基因的效率也会随着载体数的增加而大幅度地下降(Chen et al., 1988；戴顺洪等，1998)。如将目的基因构建在同一个表达载体上，多基因表达载体构建完成后，只需通过一次转化就可方便而成功地获得多价基因同时表达的转基因植物(Christou，1990)。如多价抗真菌病表达载体RC24+RAC22+RCH10(冯道荣等，2000)，AP₂₄+Glu(陈雁等, 2003), Chi+Glu(吴家和等，2004), 并且通过一次转化获得了转多价基因的抗病水稻和抗黄萎病棉花。本研究将两个抗病基因构建于同一表达载体上，通过一次转化即可获得含双价抗病基因的转基因植株，极大地提高了转化效率。

林木生长周期长，树体高大，其所遭受的病害较农作物而言更为复杂，因此选择适宜的抗病基因非常关键。兔防御素抗菌谱很广，抗性机理特殊，病原菌不易对起产生抗性，因此在植物抗病基因工程中应用极为广泛，已转入烟草(傅荣昭等，1998)、小麦(郭殿京等，1999)、杨树(赵世民等，1999)等，对细菌和病毒表现出抗性。天麻抗真菌蛋白离体抑菌实验表明多种真菌, 如小麦赤霉病菌(Gibberella saubinetic)、苹果树轮纹病菌(Macrophoma kuwatsukai)、葡萄霜霉病菌(Plasmopara citicola)、棉花黄萎病(Verticillium dahliae)和杉木炭疽病菌等(Colletotrochum gloeosporioides)均有抑菌活性¹⁾(胡忠等，1988)。可见两个基因的抗菌机制不同，抑菌谱各异，在林木基因工程中有极大的应用情景。

1) 王义琴.2001.天麻抗真菌蛋白(GAFP)的cDNA克隆、原核表达及离体抑菌活性研究.中科院遗传与发育研究所博士论文

笔者通过根癌农杆菌介导，转化烟草，获得了转双价抗病基因植株。转基因的烟草离体抑菌结果表明对根癌农杆菌、瑞氏木霉和松枯梢病菌表现出抗性，说明两个抗病基因均得到了有效的转录和表达，并且对真菌和细菌生长有一定的抑制作用，抗菌谱较单一抗病基因广。因此，本研究为进一步利用这两个基因、利用所构建的双价抗病基因表达载体转化其他植物，如林木、花卉、农作物提供了理论和实践基础。但今后还需对转基因植株所插入两个抗病基因间的相互作用以及两个基因的遗传稳定性进行深入研究。此外，本研究所构建的载体选用的启动子为组成型强表达启动子，对转基因植株本身以及环境存在一定的影响，采用组织特异型或诱导型启动子更加适宜，这还需要进一步研究。