松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是松树的一种灾难性病害的病原生物，是引起松树萎蔫病的主要原因(陈玉惠等，2001)。松材线虫病最初主要分布于美国、加拿大、日本、韩国等国家，我国于1982年秋在南京紫金山松林中首次发现该病害，之后相继在浙江、广东、江苏、安徽等省份也检测到松材线虫病害的存在，它已经对我国的松树资源构成了极大的威胁。由于目前对于松材线虫的防治尚无经济有效的措施，因此严格检验检疫是阻止该病的发生、传播和蔓延最重要的途径之一。拟松材线虫(B. mucronatus)作为伞滑刃属的线虫同松材线虫经常混生或单独出现在病树木上，两者形态极其相似，较难区分(张路平等，2000)。同工酶谱以及分子生物学的研究结果也表明二者有十分相近的同源性，给松材线虫的快速检疫以及鉴定带来了诸多的困难(胡凯基等，1995)。

自20世纪90年代初国外学者开始将RAPD技术引入到线虫的研究以来，已在植物寄生线虫的检测中使用(Hahn et al., 1996；Bendezu，1998)，Braasch等(1995)以及郑经武等(1998)也相继利用人工培养的线虫建立了松材线虫和拟松材线虫的RA PD-PCR技术，研究结果表明可在两者之间发现具有特异性的DNA片断。本试验对采自国内不同地区的20株松材线虫和拟松材线虫样品的基因多态性进行了探讨，确定RAPD方法扩增的最适随机引物以及松材线虫基因组DNA提取的最佳方法，为我国不同地区野生的松材线虫和拟松材线虫的快速检疫和种类区系分布的研究提供了样品量小、快速、简便的试验方法。

1 材料与方法 1.1 材料

试剂：蛋白酶K，Taq酶以及CTAB均购于上海生工，6个随机引物由上海生工合成，DNA Marker购于北京鼎国生物公司，其他试剂均为分析纯。

主要仪器：PCR扩增仪(2400型，PE公司)，凝胶自动成像仪(Imagemaster VDS, Pharmacia)，其他仪器均为国产。

1.2 线虫样品的取样及分离

本实验从浙江、广东、江苏、安徽、四川、湖北等地采集了黑松(Pinus thunbergii)、马尾松(P. massoniana)和华山松(P. armandi)的样木，分别采用贝尔曼漏斗法分离线虫，镜检，根据形态学分类法鉴定线虫的种类。并从松材线虫或拟松材线虫的含量较大，同时纯度在95%以上的样木中(杂有极少的线虫也只是腐生类的线虫)，筛选出了20个株系作为本实验线虫样品进行研究，其中松材线虫10株(No.1~10)，拟松材线虫10株(No.11~20)，见表 1。

1.3 线虫DNA的提取 1.3.1 SDS法

取线虫悬浮液5 μL于0.5 mL离心管中，置于液氮中反复冻融3次。加入100 μL SDS DNA提取缓冲液(200 mmol·L^-1 Tris-HCl, 250 mmol·L^-1 NaCl, 25 mmol·L^-1 EDTA, 0.5% SDS, pH 8.5)，置于55 ℃水浴中保温1 h，待冷却至室温后，用等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，冰浴后，离心，取上清液50 μL用等体积预冷的异丙醇沉淀。沉淀经70%乙醇清洗，干燥后溶于20 μL TE缓冲液中(10 mmol·L^-1 Tris-HCl, 1 mmol·L^-1 EDTA, pH8.0)，-20℃保藏备用(王扬等，1999)。

1.3.2 CTAB法

取线虫悬浮液5 μL于0.5 mL离心管中，经液氮反复冻融后，加入100 μL预热到60 ℃的CTAB DNA提取缓冲液(100 mmol·L^-1 Tris-HCl, 1.4 mol ·L^-1 NaCl, 20 mmol·L^-1 EDTA, 2% CTAB, pH 8.0)，置于55 ℃水浴中保温1 h后，经酚、氯仿和异戊醇抽提，异丙醇沉淀，沉淀经70%乙醇清洗，干燥后溶于20 μL TE缓冲液中，-20℃保藏备用(王扬等，1999)。

1.3.3 蛋白酶K法

取线虫悬浮液5 μL置于玻璃片上，用手术刀切碎，再转移到0.5 mL离心管中，加入80 μL预冷的WLB液(2.5 mmol·L^-1 DTT，1.125% Tween 20，0.025% Gelatin，2.5×PCR buffer)，以及预冷的1 mg·mL^-1蛋白酶K 20 μL，混匀，迅速将离心管放入液氮中10 min，65 ℃水浴恒温1 h，随后95 ℃恒温10 min，以灭活蛋白酶K，离心后取上清液于-20℃保藏备用(张立海等，2001)。

1.3.4 氯化苯法

取线虫悬浮液5 μL于1.5 mL离心管中，加入500 μL氯化苯提取缓冲液(100 mmol· L^-1 Tris-HCl, 40 mmol·L^-1 EDTA, pH 9.0)，10% SDS 100 μL以及氯化苯300 μL。50 ℃振荡30 min后加入3 mol·L^-1醋酸钠缓冲液(pH 5.0)300 μL，冰浴15 min后离心，取上清液加入等体积预冷的异丙醇沉淀。沉淀经70%乙醇清洗并干燥后，溶于20 μL TE缓冲液中，-20℃保藏备用(Zhu et al., 1993)。

1.4 随机引物及PCR扩增及分析

RAPD扩增的引物均使用随机引物(Braasch et al., 1995; 张路平等，2002)，见表 2，PCR扩增的基本反应条件为：25 μL反应体积中含双蒸水17 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 2 μL，10 pmol·L^-1随机引物1 μL，模板DNA 1 μL，10 mmol·L^-1 dNTP 1 μL，5 U· μL^-1 Taq酶液0.5 μL。扩增程序为：94 ℃，5 min；94 ℃，1 min，36 ℃，1 min，72 ℃，2 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

采用0.8%琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳分离，电泳缓冲液为1×TAE，电压为50 V，电泳1.5 h，置凝胶于VDS分析仪上分析测定DNA片段的长度，观察并照相。

2 结果与分析 2.1 最佳DNA抽提方法

分别采用SDS法、CTAB法、蛋白酶K法和氯化苯法从线虫(No.11)中提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA片断大小均被确认在23 kb左右，经VDS分析估算各方法提取的DNA的浓度分别为：26.0，6.4，26.4，13.3 μg·mL^-1。实验结果表明，SDS法与蛋白酶K法的提取DNA量基本相同，但明显高于CTAB法和氯化苯法。分别以上述4种方法提取的DNA为模板与6种引物组合进行RAPD扩增，进一步考察最佳提取方法和最适引物(图 1，表 3)。结果表明，经SDS法提取的DNA均可适用于上述6种引物，好于其他方法。

2.2 RAPD-PCR扩增的结果与分析

采用SDS法分别对20株松材线虫和拟松材线虫DNA进行提取，以提取的基因组DNA为模板，利用6个随机引物分别对线虫DNA进行随机扩增。扩增结果显示，所选用的6个引物基本可以区分两种线虫，线虫种内与种间均存在差异，但种间差异明显大于种内差异(图 2、3)。其中以OPB07为引物，随机扩增后，拟松材线虫于350 bp处出现特异性片段可明显的区别于松材线虫。以OPX01为引物，随机扩增后，松材线虫于850 bp处出现特异性片段可明显的区别于拟松材线虫。

2.3 聚类分析

选用OPY01为引物，随机扩增后，通过NOSA程序进行聚类分析。聚类分析结果表明，20株线虫样品明显地分为松材线虫和拟松材线虫两个不同的类群，与形态学鉴定结果一致(图 4、5)。在本次检测的样品中，拟松材线虫可以分为两类：安徽滁州和祁门(No.17, 18, 19, 20)为一类(○)，四川邻水为另一类(□)。四川邻水样本中No.12和No.13，No.14和No.15具有较高的同源性，No.11和No.16的同源性较高。松材线虫大体可以分为3类：浙江宁波(No.1, 2)和安徽滁州(No.10)为第一类(●)；江苏金坛No.4和安徽当涂No.5具有较高的同源性为第二类(■)；安徽含山No.6，9和No.7，8有较高的同源性为第三类(▲)。另外，广东惠州No.3和No.4，5具有较高的同源性也同为第二类(图 6)。试验结果表明，不同地区和寄主的松材线虫和拟松材线虫的种内具有较高的同源性，而种间同源性较低；同一地区内感染线虫的种类呈现较高的同源性，而寄主树种间的差别较小。

3 结论与讨论

松材线虫是我国重要的森林检疫性病原生物，其寄主也十分广泛，目前寄主范围已经涉及到马尾松、黑松、黄山松(P.taiwanensis)及华山松等。我国地跨热带、亚热带、温带，松属树种资源丰富，自然条件下能够染病的松属树种有9种，其中马尾松是我国南方松树中分布较广的树种，也是感病枯死较多的树种，这已在江苏、安徽、浙江、广东等的山林中得到确认。

张路平等(2002)和张立海等(2001)人曾分别采用RAPD和PCR-SSCP方法对不同株系的松材线虫和拟松材线虫的线粒体DNA和rDNA进行了分析，并证明上述方法均可以用于区分松材线虫和拟松材线虫。汪来发等(2001)也曾利用15种随机引物通过RAPD方法对松材线虫和拟松材线虫的亲缘关系进行研究，结果表明没有一种通用的引物可以一次性区分松材线虫和拟松材线虫。虽然汪来发等利用种内和种间存在的差异比较了国内和国外疫区线虫之间的亲缘性，认为松材线虫可能最初从北美通过人为活动传到日本，而后又从北美和日本再传入中国，但没有对国内疫区样品之间的亲缘关系进行分析。本研究考察了4种提取线虫基因组DNA的方法，并选取了6种随机引物对松材线虫和拟松材线虫进行了RAPD分析。试验结果表明，采用SDS法提取线虫基因组DNA最为适合，片断大小约为23 kb，略大于汪来发等人提取的21 kb DNA片断。利用OPB07为引物随机扩增后，拟松材线虫于350 bp处出现特异性片段可明显的区别于松材线虫。以OPX01为引物随机扩增后，松材线虫于850 bp处出现特异性片段可明显的区别于拟松材线虫。以OPY01为引物随机扩增后，进行聚类分析结果最佳，基本可以区分松材线虫和拟松材线虫，与形态学分类相吻合。

采用上述方法对我国华东、华中部分地区的20个株系松材线虫和拟松材线虫之间的亲缘关系进行比较，得出了以下结果：两种线虫种内和种间均存在差异，但种间差异明显大于种内差异；线虫在同一地区或临近地区的同源性明显高于其它地区；同一地区内寄主对线虫种类分布的影响较小；由于一些人为因素线虫可能被转移感染到较远的地区。

本研究采用RAPD聚类分析的方法探讨了我国部分地区松材线虫和拟松材线虫的种类和分布，该方法具有所需样品量少、检测灵敏度高、结果准确等优点，将为松材线虫的种群亲缘关系、传播途径及其检测防疫等方面的研究提供一套灵敏、可靠的方法。但由于目前我们采集的样品数量以及采集地区存在一定的局限性，同时PCR扩增以及RAPD分析也具有一定的不稳定因素，因此该方法和结果还有待进一步完善。