山西杉苞蚧(Physokermes shanxiensis)属蚧总科(Coccoidea), 蚧科(Coccidae), 坚蚧亚科(Eulecaniinae)的杉苞蚧属(又称云杉球蚧属)(Physokermes Targioni-Tozzetti) (Hodgson, 1994), 该属在世界上已经记录11种, 其中新北区4种, 古北区7种, 均寄生在松科(Pinaceae)植物上, 如冷杉(Abies)、云杉(Picea)、松(Pinus)、黄杉(Pseudotsuga)等。我国记载3种, 即红皮云杉球蚧(Physokermes inopinatus)分布黑龙江和吉林省, 危害红皮云杉、鱼鳞云杉、白扦、青扦等。蒙古杉苞蚧(Physokermes sugonjaevi)分布新疆和山西省, 危害云杉属植物(谢映平, 1998)。山西杉苞蚧(Physokermes shanxiensis)是1991年由汤枋德先生采集于山西太原市云杉上的一个新种。它为两性生殖, 1年发生1代, 夏秋两季若虫在针叶上刺吸取食, 从入冬到仲夏则由老龄若虫和成虫在枝条上寄生, 近10余年来该虫在太原市和山西中部地区的云杉上密度很大, 危害甚烈, 并发现该蚧虫对城市空气污染具有一定的适应性和抗性。由于该蚧虫在若虫和成虫期均能分泌蜡质, 对虫体起保护作用, 防止了天敌和不良天气对它的侵袭, 同时, 也降低了杀虫剂的杀伤效果, 显示了很强的生存优势。对山西杉苞蚧的研究以往主要局限于形态学和生物学特性的观察与描述(汤枋德, 1991; 谢映平, 1998; 武三安等, 2000), 对蜡泌物的研究未见报道。事实上, 研究蚧虫分泌蜡质的形态结构和化学成分对于了解其生存优势、自我防御机制, 以及改进防治对策, 具有重要意义。

尽管紫胶虫(Kerria lacca)和白蜡虫(Ericerus pe-la)等有益蚧虫的蜡泌物早就被开发利用, 但对其他蚧虫蜡泌物的超微结构和化学成分的研究还是从20世纪60年代后期, 随着电子显微镜的应用和光谱技术的发展才开始活跃起来(Hackman, 1951; Kawai et al., 1967, Tamaki et al., 1968; Tamaki, 1969; Hashimoto et al., 1971; Brown, 1975)。截止目前, 已研究过蜡泌物的蚧虫约20种, 与蚧总科全世界7 000余种的数量相比, 非常贫乏。其中蚧科是蚧总科内第3大科, 在世界上记录1 000余种, 是虫体泌蜡量最多的一个类群, 但是, 该科内蜡泌物研究也仅占约1%(Tamaki, 1967)。我国蚧虫700余种, 现在只有瘤坚大球蚧(Eulecanium gigantium)、朝鲜毛球蚧(Didesmococcus koreanus)、背刺毡蜡蚧(Eriopeltis festucae)和云南双蜡蚧(Dicyphococcus bigibbus)的蜡泌物研究作过报道(谢映平等, 2002; 2003a; 2003b; 2004)。本文采用电子显微镜、红外光谱、气相色谱和质谱联用技术, 研究了采自山西太原市和太谷县云杉上山西杉苞蚧的蜡泌物的超微结构和化学成分, 这也是本属蚧虫蜡泌物的首次研究, 同时发现该种蚧虫蜡泌物的超微结构和化学成分与上述研究过的同科其他属的几种蚧虫有较大不同, 希望对认识该类蚧虫泌蜡机制和改进防治措施方面能提供新思路。

1 材料与方法 1.1 虫体材料的采集

试验材料为山西杉苞蚧, 采集于山西省太原市街道和位于太谷县的山西农业大学校园的绿化树木云杉(Picea asperata)。采集若虫的时间在8月下旬, 采集成虫蜡泌物的时间在4月下旬到5月上旬。采集时用枝剪将带虫的枝条和针叶剪下, 带回实验室备用。

1.2 蜡泌物的扫描电镜观察

将带虫枝条带回实验室, 真空干燥后, 挑选蜡壳完整的适当虫体置样品台上, 真空条件下喷金5~7 min。用扫描电镜观察虫体表面泌蜡结构并摄影。扫描电镜型号: KYKY-AMRAY 100B。

1.3 蜡泌物的处理和红外光谱检测

将真空干燥后的蜡泌物从枝条上用镊子或解剖针取下, 置试管中用三氯甲烷(CHCl₃)溶解、萃取。待蜡溶解后, 过滤, 挥发掉三氯甲烷, 得到白色固体的蜡泌物样品。按照红外光谱的固体压片法制样(董庆年, 1979), 红外光谱仪检测。仪器为美国Nicolet公司产Fourier变换红外光谱仪, 型号: MAGNA 560型FTIR。红外光谱特征解析参考红外光谱法、光谱分析与有机结构鉴定、有机化合物结构鉴定与有机波谱学等(宁永成, 1989; 赵瑶兴等, 1992)。

1.4 蜡泌物的处理和气相色谱/质谱仪联用GC/MS检测

山西杉苞蚧雄性虫体发育到2龄后期, 分泌的蜡质形成略微扁平、白色、半透明蜡壳, 在此蜡壳内, 雄虫完成其预蛹、蛹、成虫的发育, 然后羽化, 破壳而出。试验采用雄虫刚羽化后留下的空蜡壳作为材料, 测试方法分为直接测试和甲酯化后测试2种。直接测试, 即将一定量蜡壳放于小试管内, 注入正己烷(C₆H₁₄), 经超声波振动, 使蜡质溶解后, 用GC/MS联用仪检测。经甲酯化后检测是首先将蜡泌物甲酯化, 然后检测。步骤是:称NaOH(固体)约300 mg, 放在小三角瓶内, 加入15 mL甲醇(CH₃OH), 摇动溶解。将蜡泌物放入试管内, 注入NaOH-CH₃OH溶液5 mL, 给试管内充N₂, 加塞, 振摇后置50 ℃水浴箱中1 h, 让其充分溶解。从水浴中取出, 在通风橱内加三氟化硼-甲醇溶液(BF₃-CH₃OH) 3 mL, 摇匀, 于50 ℃水浴中20 min, 取出冷却至室温。加正己烷2 mL, 加饱和溶液5 mL, 摇匀, 静置分层。吸取上清液保存在另一试管中, 作为上机检测样品。该试管预先放入少量Na₂SO₄(粉末)。最后用GC/MS联用仪检测, 每次进样量0.2 μL。仪器为英国ThermoQuest仪器公司生产的Trace GC2000/MS, 毛细管柱为30 m×0.25 mm, DB-5MS柱。

1) 不经过甲酯化的样品直接检测:柱温初始50 ℃, 初始时间1 min, 第1次升温速率4 ℃·min^-1, 升至300 ℃, 保持10 min; 第2次升温速率10 ℃·min ^-1, 升至310 ℃, 保持10 min, 最大温度控制为350 ℃。2)甲酯化后样品检测:柱温初始50 ℃, 初始时间1 min, 第1次升温速率10 ℃·min^-1, 升至220 ℃, 保持0 min; 第2次升温速率5 ℃·min^-1, 温度升至280 ℃, 保持30 min; 第3次升温速率10 ℃·min^-1, 升至310 ℃, 保持3 min, 最大温度控制为350 ℃。

2 结果与分析 2.1 蜡泌物的扫描电镜观察结果

观察发现, 杉苞蚧一龄若虫初期背面没有泌蜡腺体, 仅靠体壁表皮细胞分泌少量蜡质。1龄和2龄雌雄两性若虫的泌蜡均为湿蜡, 凝结在虫体背面为小颗粒, 均匀散布(图版Ⅰ-1)。已经知道, 2龄雌性若虫背面出现短管状腺体, 管端开口5~9格, 在体缘呈一条细带状, 在亚缘区从前胸至腹部第4节, 呈短纵带分布(武三安等, 2000)。本次电镜观察该龄期虫体背面蜡质增多。当雄性2龄若虫发育结束, 蜡泌物凝结形成薄层蜡壳, 白色半透明(图版Ⅰ-2)。蜡壳分为几个小区, 即头部1片, 呈盾形; 体前侧区两边各1片; 胸部中区1片, 较大; 体侧面两边各1片; 腹部背中1片; 腹末端肛前区1片; 体后侧两边各2片。放大1 000倍下可以看到蜡壳是由不同的小蜡块凝结形成(图版Ⅰ-3)。雌虫进入3龄后, 虫体背面分泌白色长蜡丝, 略卷曲, 具光泽(图版Ⅰ-4), 在虫体周围形成疏松蜡团。蜡丝从第2龄期分泌的薄蜡层裂缝中伸出, 蜡丝在虫体缘区和亚缘区从前向后排列, 与该虫体在第2龄后期背面发育出管状腺体分布相对应(图版Ⅰ-5、6)。放大600倍时, 可以透过半透明蜡层看到泌蜡腺体端口呈小圆孔状(图版Ⅰ-7), 放大1 500倍可见泌蜡腺孔为五格腺和六格腺(图版Ⅰ-8)。

2.2 蜡泌物红外光谱特征分析

图 1显示, 在饱和碳氢(—C_nH_m)的伸缩振动区域(2900cm^-1)附近, 出现3个吸收强度很强的峰群。2917.5 cm^-1和2849.0 cm^-1出现的2个峰为＞CH₂的特征吸收峰, 其中2 917.5 cm^-1处的吸收峰强度最大。2955.2 cm^-1处的中等强度峰表明蜡泌物中存在的甲基(—CH₃)较多。根据3个吸收峰的强度可知, 蜡泌物中＞CH₂的数目远大于—CH₃的数目, 所以推测化合物具长碳链结构。

在1 733.2 cm^-1处的强吸收峰说明蜡泌物中存在一种含羰基(CO)的化合物。据吸收峰位置推测, 蜡泌物是含有带羧基(—CO₂H)、羰基(CO)或脂基(—CO₂R)官能团的化合物。在1 636.7 cm^-1处的吸收峰说明蜡泌物中可能含不饱和烯基化合物。在1 473.1 cm^-1和1 463.1 cm^-1处中等强度吸收峰, 以及1 417.0 cm-1附近的吸收峰, 为CH₂的变形振动, 与2?917.5 cm^-1处的碳氢(—C_nH_m)伸缩振动相印证。从1 377.1 cm^-1处到1 179.2 cm^-1之间的锯齿状峰为饱和碳链—C—C—C—的骨架振动。表明蜡泌物是由长碳链化合物组成。在1 112 cm^-1和1 060 cm^-1附近出现2个独立的吸收峰, 可能为醇的C—O键伸缩振动, 因此推测蜡泌物中含醇的化合物。730.0 cm^-1和719.6 cm^-1处的2个中等强度吸收峰为芳香碳氢(Ar—H)的同位相面外弯曲振动, 由此推测, 蜡泌物中含有一些带有芳香官能团或多环化合物的衍生物。

杉苞蚧雄性成虫的蜡壳的是由2龄若虫化蛹前分泌的湿蜡凝结成的薄蜡片构成, 不同于雌成虫体表分泌的蜡丝。比较它们的红外光谱特征(图 2), 发现二者的明显区别在于:1)雄性蜡质光谱在1 738.9 cm^-1处出现2个吸收峰, 雌成虫的只有1峰, 说明蜡泌物中含的羰基种类前者多于后者。2)雄性蜡质光谱在1 367~900 cm^-1之间出现3~4个离散的独立吸收峰, 分别位于1 241.8、1 172. 8、1 041.8和911.2 cm^-1处, 它们都属于C—O键或C—N键振动的吸收峰。根据峰位推测蜡泌物中可能存在醇、酚或含N的化合物。在此频率范围内, 雌成虫蜡泌物光谱特征是一系列锯齿状峰, 为饱和碳链—C—C—C—的骨架振动, 表明蜡泌物是由长碳链化合物组成。

杉苞蚧蜡泌物的化学成分主要是饱和或不饱和长碳链烃、脂肪酸、脂肪醇、酮类或醛类以及带芳香烃或多环结构的化合物及其衍生物构成。根据杉苞蚧泌蜡物的红外光谱特征, 可以将它和其他种属区别开来。根据雌成虫分泌的丝状蜡质和雄性分泌的湿蜡光谱特征存在的明显差异, 可以分析其不同性别间蜡质的变化。

2.3 雄成虫蜡壳的化学成分分析

蜡泌物经过甲酯化处理后检测得到色谱图(图 3), 从图中看出, 蜡泌物进样后出峰集中在保留时间为14.16~36.20 min之间, 共9个峰, 包含7个组分(表 1)。化合物仅2类, 以酸甲酯为主要成分, 它们在蜡泌物中实际物质是长链脂肪酸, 占6个组分, 相对含量达89.20%。其中饱和烷酸有C₁₂—、C₁₄—、C₁₆ —、C₁₈—和C₂₀—酸, 全部为偶数个碳原子, 占脂肪酸总量的74.13%;不饱和酸是C₁₈—烯酸, 该组分占25.87%。第2类为C₂₇—烷烃, 占总组分的10.80%。

蜡泌物不经甲酯化处理检测得到色谱图(图 2), 从图中看出, 蜡泌物进样后出峰集中在保留时间为44.66~66.82 min之间, 共18个峰, 包含7个组分(表 2)。化合物归为烃、醇、醛、酯4大类。烃类全部为长链饱和烃, 分别为C₂₁—烃, 占5. 09%, 集中出现在保留时间为44.66-52.83 min峰位的范围内。C₂₈—烃, 占70.65%, 出现在保留时间为54.70~59.94 min和61.55~63.31 min之间的7个峰位上。脂肪醇2种, 分别为长链不饱和C₂₂—烯醇(占3.50%)和饱和的C₃₂—烷醇(占1.97%), 醛类化合物是C₁₈—醛(即硬脂醛), 占3.68%。酯类化合物是乙酸十四烯酯(C₁₆—), 占10.85 %。

综上所述, 此蚧虫蜡泌物的主要化学成分是C₂₁—、C₂₇—、C₂₈—的长链饱和烃; 饱和脂肪酸, C₁₂—、C₁₄—、C₁₆—、C₁₈ —和C₂₈—的烷酸和不饱和的长链C₁₈—烯酸; 不饱和C₁₆—酯; 饱和C₃₂ —烷醇和不饱和C₂₂—烯醇; 以及C₁₈—硬酯醛。在长链脂肪酸、脂肪醇、醛、酯化合物中, 碳原子数目均为偶数。

3 讨论

通过扫描电镜观察发现, 山西杉苞蚧在第1、2龄期雌雄两性分泌的蜡质均为湿蜡, 在虫体表面形成薄蜡壳, 当雌性若虫发育到第3龄期和成虫期分泌的蜡质为丝状构造。这与报道的蚧科的云南双蜡蚧(Dicyphococcus bigibbus Borchsenius)的泌蜡特征差别明显(谢映平等, 2004)。云南双蜡蚧在若虫和成虫期均分泌湿蜡, 在虫体表面形成一定形状的玻璃状半透明蜡壳。从红外光谱特征也可以发现, 山西杉苞蚧的雄成虫蜡质光谱和雌成虫蜡质光谱特征均与云南双蜡蚧的不同, 主要表现在云南双蜡蚧的光谱吸收峰属于密集尖锐型, 而且与超微结构相对应, 山西杉苞蚧的雄性蜡质光谱和雌成虫蜡质光谱特征在波数为1 800~1 000^-1之间, 存在明显差别, 说明雄性蜡质和雌成虫蜡质所含化学基团及组成的化合物不同。但云南双蜡蚧雄性蜡质和雌成虫蜡质, 若虫期和成虫期的蜡质光谱的吸收峰的形状和数量是非常相似, 这反映出云南双蜡蚧不同虫态和雌雄性别之间的泌蜡成分差异很小。从蜡泌物的GC/MS检测结果对比也可以看出, 山西杉苞蚧的雄性蜡质的化学组分与云南双蜡蚧的差别很大。特别是云南双蜡蚧的蜡泌物中含多种长链酯, 而山西杉苞蚧雄性蜡质中只有1中长链酯。从上述2种蚧虫所在的亚科比较, 山西杉苞蚧属于坚蚧亚科, 云南双蜡蚧属于蚌蜡蚧亚科(Cardiococcinae) (Hodgson, 1994), 因此, 通过蜡泌物的形态结构和化学成分也反映了它们在分类地位和亲缘关系上的距离较远。

坚蚧亚科包括12属(Hodgson, 1994), 除了本文研究的杉苞蚧属(Physokermes)外, 已经报道过蚧虫蜡泌物超微结构和化学成分的还有球坚蚧属(Eulecanium)的瘤坚大球蚧(Eulecanium gigantium Shinji)、毛球蚧属(Didesmococcus)的朝鲜毛球蚧(Didesmococcus koreanus Borchsenius)(谢映平等, 2001; 2002)。与它们相比, 本文研究的杉苞蚧蜡泌物的形态与其他属种差别较大, 比如与朝鲜毛球蚧和瘤坚大球蚧的均不同。特别在第1、2龄期朝鲜毛球蚧分泌长丝状结构的蜡, 而本虫分泌湿蜡, 形成薄片状蜡壳。朝鲜毛球雌性3龄若虫和成虫分泌湿蜡, 与本虫的丝状蜡不同。瘤坚大球蚧在第1、2龄期分泌湿蜡, 但在虫体背面形成一个龟背状壳, 雌性3龄若虫和成虫期分泌丝状蜡, 但其蜡丝为空心管状, 在虫体表面形成弹簧状弯曲, 这些特征与本种泌蜡规律皆不同。因此, 本文在蚧科昆虫蜡泌物超微结构上是新发现, 对深刻认识这些相近属的分类特征和采取相应防治措施都有新的意义。

从化学成分研究看, 本文重点研究雄性蜡壳的化学成分, 以前的报道均是雌性蚧虫。杉苞蚧属主要寄生云杉, 在世界上对该属蚧虫还没有关于泌蜡结构和化学成分的报道。需要指出的是, 本研究化学成分的确定是通过气相色谱-质谱联用仪分析并由该化合物数据库中对照检索, 因此有部分化合物只是能鉴定到相似的一类, 今后在此基础上还应经过分析, 认为在生物学上是有重要意义的化合物类型, 再进行色谱柱分离和核磁共振等系列方法, 明确鉴定其结构, 可能会发现一些新的化合物。