大叶黄杨(Euonymus japonicus)为卫矛科(Celastraceae)卫矛属常绿灌木或小乔木，具有较强的抗寒性，在长城以南各大城市的园林绿化中应用较广，冬季表现较好，但在气候稍差的地方常出现低温伤害现象，又兼之病虫害较普遍(李庚花等, 1998; 惠彦文, 1998)，维护费用高。目前，国内外已有关于大叶黄杨近缘植物的组织培养研究，如金叶卫矛(E. fortunei cv.“Gold”)(于萍等，2000)和红果冬青(E. japonicus cv. “hong”)(夏海武，2001)的组培快繁，肉花卫矛(E. carnosus)(刘非燕等，1996)、欧洲卫矛(E. europaeus) (Bonneau et al., 1994; 1995;Biahoua et al., 1999)和小叶卫矛(E. alatus)(Smith et al., 1989)的植株再生，未见有关大叶黄杨植株再生的研究报道。为改善大叶黄杨的观赏效果并降低养护成本，本试验对其再生体系进行了研究，并对再生过程中不定芽的起源进行了探讨，以便为今后通过转基因技术或诱变育种技术培育具有特定性状的新品种奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

以大叶黄杨试管苗(北京市园林科学研究所提供)为试验材料。

1.2 方法

1) 外植体获取  取试管苗顶端3节幼嫩无芽茎段，剪成长2 mm的切段为外植体，平行接种到诱导培养基上。

2) 生长调节剂组合对不定芽诱导的影响  不定芽诱导培养基以MS培养基为基本培养基(琼脂4~5 g·L^-1，白糖20 g·L^-1，pH5.8)，附加不同浓度的6-BA和NAA、IBA或IAA(表 1、2)。每瓶接种8~10块，每处理4瓶，重复3次。接种60 d后统计不定芽再生情况。培养室温度为(24±2) ℃，光强36 μmol·m^-2s^-1，每天光照14 h。

3) 碳源种类和浓度对不定芽诱导的影响  以MS培养基为基本培养基(琼脂4~5 g·L^-1，pH5.8)，附加1.3、1.5、1.7 mg·L^-1的6-BA和0.005 mg·L^-1的IBA。分别以白糖、蔗糖和葡萄糖为碳源。60 d后统计再生情况，以3种生长调节剂组合下不定芽再生率的均值计算不同种类和浓度的碳源对大叶黄杨无芽茎段不定芽诱导的影响。培养室环境同2)。

4) 不定芽起源研究  以MS+6-BA 1.5 mg·L^-1+IAA 0.005 mg·L^-1+琼脂4.5 g·L^-1+白糖20 g·L^-1(pH5.8)为诱导培养基。接种后3、5、8、11、14 d时取外植体用卡诺固定液(冰醋酸:酒精= 3:1)固定24 h，70%酒精保存。用梯度酒精进行硬化与脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚5 μm(手动切片机，浙江金华无线电厂)，番红(Safranine T，Fluka进口分装)固绿(Fast green FCF，Chroma进口分装)对染(孙树兴，1996)，Nikon 104生物显微镜镜检并摄影(Nikon AFX-ⅡA自动曝光)。

2 结果与分析 2.1 生长调节剂种类与浓度变化对大叶黄杨无芽茎段再生不定芽的影响

大叶黄杨无芽茎段不定芽诱导试验结果(表 1)表明：MS+6-BA 1.7 mg ·L^-1+ IBA 0.005 mg·L^-1、MS+6-BA 1.9 mg·L^-1+ IBA 0.03 mg ·L^-1和MS+6-BA 1.7 mg·L^-1+ IAA 0.005 mg·L^-1有利于大叶黄杨无芽茎段分化产生不定芽，分化率分别达到52.4%、46.7%和40.0%，不定芽生长旺盛(图版Ⅰ-1); IBA含量为0.01 mg·L^-1时，对不定芽的诱导效果非常稳定。在接种后14d肉眼可见外植体表面有绿色突起出现(图版Ⅰ-2)，两端切口上有少量白色愈伤组织产生，到20 d时有肉眼可见的不定芽产生(图版Ⅰ-3)，不定芽的产生可一直持续到接种后50 d，多数不定芽产生自外植体的近切口处; 两端切口上持续有愈伤组织产生，并逐渐变为绿色(图版Ⅰ-4)。

2.2 碳源对大叶黄杨无芽茎段不定芽诱导的影响

试验结果表明：20 g·L^-1的白糖、30 g·L^-1的蔗糖和葡萄糖对大叶黄杨无芽茎段不定芽的诱导有利。10~30 g·L^-1范围内，随葡萄糖浓度的增加不定芽再生率升高，但以葡萄糖为碳源时不定芽玻璃化严重，叶片不能展开; 培养基在室温下放置14 d后接种，玻璃化明显减轻，多数不定芽的叶片开展，生长正常(图 1)。

2.3 不定芽的发生与起源

试验结果说明，以大叶黄杨无芽茎段和下胚轴为外植体时，不定芽起源于表皮或近表皮等表层组织。外植体培养到第8天时，表层组织脱分化产生分生组织(图版Ⅰ-5、6)，到第11天时即出现芽原基(图版Ⅰ-7)，第14天时有完整芽生成(图版Ⅰ-8)。

2.4 不定芽的增殖与生根

把具有4片叶以上的不定芽接种到增殖培养基(MS+6-BA 1.0 mg·L^-1+NAA 0.3 mg·L^-1)上，每40天继代一次，增殖系数可达3~5(图版Ⅰ-9)。增殖后接种到仅附加生长素的1/2MS(白糖20 g·L^-1)生根培养基上，30 d后不定根开始形成，40 d后可形成较完整的根系(图版Ⅰ-10)。

3 小结

本试验建立了大叶黄杨以无芽茎段为外植体的植株再生体系，其最高分化率达到了52.4%，把再生的不定芽转接到生长和增殖培养基上后生长正常。多数不定芽产生于外植体切段靠近切口处，茎段中间部分只产生少量不定芽，且产生时间稍晚。Kelkar等(1998)在以胡椒属的Piper colubrinum的无芽茎段为外植体的试验中也观察到类似结果。

已经发表的有关卫矛属植株再生试验表明，卫矛属不同种间对外源植物生长调节剂的诱导效应明显不同; 本课题正在进行的不定芽再生试验也显示，扶芳藤(E. fortunei)、小果卫矛(E. microcarpus)和胶东卫矛(E. kiautschovicus)对外源植物生长调节剂的敏感性存在很大差异。目前建立了扶芳藤以下胚轴和无芽茎段(王茂良等，2004)，小果卫矛以下胚轴和子叶为外植体的不定芽再生体系，并都实现不定芽的增殖和生根。

以大叶黄杨的无芽茎段为外植体时，不定芽起源于其表层组织，这与Smith等(1989)在小叶卫矛上的结果相同。以桉属Eucalyptus gunnii的茎段为外植体进行的不定芽诱导试验表明，其不定芽也起源于茎段在培养过程中所产生突起的外缘组织(Hervé et al., 2001)，说明可以利用这一不定芽再生体系进行大叶黄杨转基因和诱变育种研究。