文章信息
- 王军.
- Wang Jun.
- 青枯菌对植物的致病机制及其调节
- The Mechanism of Pathogenicity and Its Regulation of Ralstonia solanacearum to Plants
- 林业科学, 2005, 41(3): 142-147.
- Scientia Silvae Sinicae, 2005, 41(3): 142-147.
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文章历史
- 收稿日期:2003-03-19
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青枯菌(Ralstonia solanacearum)是一种革兰氏阴性,杆状,广泛分布于热带、亚热带地区,引起包括作物与林木毁灭性青枯病的病原菌(Hayward, 1994)。青枯病菌过去分类上一直属假单胞杆菌属(Pseudomonas)。Yabuuchi等(1992)根据该菌16S rRNA序列、DNA-DNA比较同源性、脂肪酸组成等性状,将其置于布克氏菌属(Burkholderia);后来通过系统发育与多相表型分析又发现其不同于布克氏菌谱系,因此移入一个新属Ralstonia (Yabuuchi et al., 1995)。
由于青枯病发生的广泛性和经济上的重要性,过去50年间,人们一直没有停止过对其致病机制的的研究(Hayward, 1991; Kelman, 1953)。尤其是近10多年来,随着植物病理学及其相关学科的发展,人们从解剖生理、生物化学及分子遗传学等各个层面对青枯菌引起的植物枯萎的原理和机制作了更为深入细致的研究并取得了长足进展。本文旨在总结迄今对青枯菌致病机制的认识和了解,并对还存在的问题和未来走向作一些探讨。
1 青枯菌的侵染过程青枯菌的生活史包括了寄生和腐生2个阶段,在入侵寄主植物前,该菌可以长期宿存于土壤、杂草及一些非寄主植物中(Granada et al., 1983; Moffett et al., 1980)。当寄主植物种植于带菌土壤,在条件适宜时,病菌便可接触根部而侵入。病原细菌与寄主根系的接触是否涉及到趋化性目前还不清楚。一些研究揭示菌体上的纤毛可能对细菌最初的吸附及毒性起着作用(Romanstschuk, 1992; Kang et al., 2002);而病原细菌的游泳运动性被证明对于早期侵染和定殖寄主植物是非常重要的(Trans-Kersten et al., 2001)。罗焕亮等(2002)发现细菌外膜的脂多糖(LPS)有助于青枯菌识别和吸附到木麻黄(Casuarina equisetifolia)根表细胞。接种蕃茄(Lycopersicon esculentum)的细菌不同LPS组成会影响到其诱导植株产生过敏性坏死的能力(Whatley et al., 1980)。从对蕃茄幼根电镜观察显示,根毛区的根毛细胞吸附细菌量最多,其余依次是伸长区、根冠区和成熟区,吸附方式有横卧式、微菌落吸附和随机分散吸附, 病原细菌在次生根萌生处及薄壁细胞外层部分细胞脱落之处大量繁衍(王卉等,1993)。
青枯菌进入植物根表一般需要伤口或天然孔口。在番茄幼根上,细菌往往从根尖伸长区和根毛区细胞交界处的缝隙以及细胞生长中自然造成的裂口侵入(王卉等,1993);接种到具完整表皮的根段不能引起侵染,但将接种体置于次生根萌发之处则导致侵染成功(Kelman et al., 1965)。但Saile等(1997)检测到土壤接菌后仅4 h,非病原的大肠杆菌(Escherichia coli)就已存在番茄根部皮层中,认为青枯菌对植物根部的进入在很大程度上是非特异性的。
根据Vasse等(1995)对水培蕃茄的接种观察,青枯菌侵染过程可分为3个阶段:1)病原菌定殖于根的外围部分;2)入驻皮层的细胞间隙并侵染维管薄壁细胞;3)通过直接穿透导管分子壁或由接触细胞形成的侵填体释放而侵入木质部导管分子。此外,病菌也可经伤口直接进入导管(王军等,1997a),一旦进入导管,病菌便可借助蒸腾液流迅速扩散到植物全株,导致受侵植物的枯萎和死亡。
2 青枯菌的致萎机制对于青枯菌引起的番茄枯萎,Wallis等(1978)认为可能是由于导管被细菌、胶质及侵填体等堵塞造成。Monsalud (1999)观察到受侵植物一些次生根及茎维管束完全被病菌堵塞。番茄下胚轴根茎区维管束内只要有25%的导管被细菌定殖,即可引起整株枯死(Vasse et al., 1995)。病菌对初生和次生木质部组织都能定殖,在导管中大量存在,导致导管纹孔膜瓦解,相邻的薄壁组织坏死(Nakaho et al., 2000)。Saile等(1997)观察到番茄植株整个茎段在被病菌定殖前并不开始萎蔫,但一旦萎蔫,便很快枯死。Grimault等(1994)提出可能存在一个引起症状发生的细菌增殖密度门槛,只有当维管束内细菌密度超过这一门槛,才能引起枯萎。但McGarvey等(1999)的试验显示如仅是大量细菌在输水导管中存在,并不一定能导致枯萎症状的发生。
在辣椒(Capsicum annuum)上,枯萎的发生主要归因于病原细菌迅速而严重的定殖(Rahman et al., 1999)。显微观察根茎切片显示接种48~96 h,大量细菌个体存在于木质部导管,细菌还定殖于维管薄壁细胞,一些维管接触细胞迅速瓦解,细胞质扭曲;接种120~144 h后,导管壁中胶层分离,导管破裂,细胞质紊乱;接种后168 h,大多数植株显示枯萎症状,这时由于导管壁破裂,在维管腔充斥大量细菌,并扩展到相邻组织。
在木本植物上,病菌被发现存在于桑树导管以及周围的薄壁细胞和维管形成层细胞(邱醒球等,1990)。木麻黄皮层薄壁细胞,髓射线薄壁细胞也有受侵染的迹象(王军,1996)。肖练章等(1983)认为树木导管的损伤破裂,侵填体的形成等因素是造成桑树输水困难而萎蔫、枯死的原因。由于细菌过滤液也能使木麻黄小枝迅速致萎,王军等(1997b)认为病原菌本身对导管的机械堵塞可能不重要,枯萎涉及到某些毒性物质的作用。
青枯菌对植物根表和皮层的侵入与其穿透维管系统的能力可能涉及到不同的机制。Vasse等(2000)观察到一病菌突变型在接种番茄根部6 d后,已于细胞间隙广泛存在,12 d后将皮层细胞全部破坏,但却未能穿透和定殖于维管束,病菌穿透内皮层进入维管束的能力较之于侵入根表和皮层对于整个侵染的成功似乎更为重要。青枯菌通过天然途径或经人工接种进入植物木质部导管并迅速增殖和扩散是引起枯萎症状的直接原因。
3 致病因子及其作用 3.1 胞外多糖青枯菌在培养基上和植物体内可产生大量的粘性物质,Husain等(1958)认为这些粘性物质可能通过阻塞维管束而在致萎过程中起着重要作用,大量粘性物质在导管中的存在阻碍了液体流动,导致输水困难和停止。经分析,青枯菌粘性物质成分主要(>90%)为高分子量并包含3种氨基糖的酸性胞外多糖(EPSI)。不少研究通过用EPSI缺陷型突变菌系与正常产生EPSI的野生型菌系的致病性比较发现,即使将大量细菌注射入植物茎干,前者极少引起植物的萎蔫和死亡(Denny et al., 1990; Denny et al., 1991; Kao et al ., 1992; McGarvey et al., 1999; Saile et al., 1997)。EPSI的致萎机制主要有以下几个方面:1)堵塞导管(Husain et al., 1958; Denny et al., 1990);2)产生过度流体静压力而使导管破裂(Schouten 1989; Van alfen, 1989);3)促进细菌在植物体内的移动、扩散和定殖,试验表明,EPSI缺陷突变型对番茄茎的定殖不如野生型迅速,即使在植株内突变型与野生型一样增殖,但它们在茎内的扩展并不如野生型那样广泛,EPSI缺陷突变病菌在植物体内的移动性大大降低;4)保护细菌免遭植物的抗病反击(Schouten, 1989),有证据显示EPSI可以掩盖脂多糖(LPS)以使细菌避开寄主的识别和攻击(罗焕亮等,2002)。
尽管如此,关于EPSI在青枯菌的致病过程中的精确作用目前还少有试验可以提供结论性的证据。由于EPSI为大分子复杂的多聚物,对其纯化、化学组成、结构、大小等的了解以及置于显微镜下的观察都很困难,因此,试验研究受到限制;还由于胞外多糖的产生涉及到许多基因和复杂交织乃至重叠的生物合成途径,突变试验具有未知的副作用,特别是当生物合成的前体或与细菌相关联的多糖受到影响时,情况就更显著。因此只有集合生化、遗传及病理过程等足够的资料,进行多重研究,才可能取得有意义的进展。
3.2 胞外蛋白已知青枯菌能产生10种左右的胞外蛋白,其中属于果胶酶的包括果胶甲基脂酶(Pme)和3种聚半乳糖醛酸酶(PG)。在植物体果胶富集的部位,这几种酶将果胶质肢解成低聚物并为病菌提供半乳糖醛酸作为生长基质。Trans-kersten等(1998)的研究显示Pme为病菌生长于甲基化果胶质基质上所需,但并不是引起枯萎的毒性因子,而PG尤其是内聚半乳糖醛酸酶(PglA或PehA)缺陷突变型就至少需要花费双倍于野生型的时间以使番茄枯死(Schell et.al., 1988)。PG并不作用于病菌的致病性,而只是加强病菌的定殖和侵袭能力,因此对于病害的发展PG并非是必不可少的(Boucher et al., 1992)。Gonzalez等(2003)的试验表明单独的胞外PG对致萎性的贡献并不显著。
内葡聚糖酶(Egl),一种纤维素酶,通过降解细胞壁上的纤维性葡萄糖,可能对青枯菌入侵植物根部和穿越木质部导管起着一定的作用。研究发现内葡聚糖酶缺陷突变型引起的病害症状较野生性发展更慢,对根茎的入侵和定殖,在速度和效率上都有所降低;然而,受感染植物的比例与野生型接种的一样多,并且在大多数情况下,侵染最终会导致植物完全枯萎(Roberts et al., 1988)。
3.3 Ⅲ型分泌系统及其输出产物青枯菌具有一个含20多个基因的hrp基因串,该基因串具有5个转录单位,编码20多种多肽,这些多肽组成Ⅲ型(Type Ⅲ)分泌系统(Hueck, 1998)。该系统对于细菌搬运毒性因子或非毒性蛋白直接进入植物细胞,促进病原细菌获得营养或抑制寄主防御反应起着作用(Mudgett et al., 1998),其中任一基因的钝化都会导致病原细菌失去致病能力和在植物体内的增殖,以及引起植物过敏性防御反应的能力(Boucher et al., 1992)。有研究表明Type Ⅲ系统的过敏性反应蛋白(Hrp)对于细菌与植物发生联系如纤毛的形成是必不可少的(Gijsegem et al., 2002),Hrp缺陷型菌株失去了对植物的定殖和在植物体内增殖的能力(Kanda et al., 2003)。但关于这些基因的编码产物及其在致病过程中的作用目前还知道的不多。
4 致病性的调节青枯菌的表现型转换(PC)是指病菌胞外多糖和一系列胞外酶产生协调性变化而最终导致表现型改变的一个现象:失去致病性并出现菌落形态的变化。研究显示,青枯菌进化出了一套非常复杂而有异常灵敏的感知外界环境并作出反应的网络,这个网络的核心就是调节致病性的表现型转换(Phc)系统。Phc系统包括了一个38.6 ku结合蛋白(多肽),一个R-赖氨酸型转录调节子和PhcBSRQ操纵子产物(Brumley et al., 1993)。当活性PhcA处于高浓度时,细菌细胞产生大量主要的毒性因子,如EPSI及一些胞外酶;而当PhcA失活时,细菌产生非常少的胞外蛋白,几乎不产生EPSI。但与此同时,PglA和可能的hrp分泌系统产物的生产则出现上升。
PhcA系统的调节开始于细菌对其细胞密度或拥挤度的反应。Mark (Schell, 2000)概括了如下模型细节:当细菌细胞生长缓慢或生长迅速但散布于土壤、水体等开放环境时,由PhcB基因合成的3-羟基棕榈酸甲基酯(3-OH PAME)由于发散稀释达不到5 nmol·L-1的PhcA激活门槛。在这种情况下细菌是活动的,产生含铁细胞,纤毛和一些其他被活化PhcA抑制的因子,而且不会浪费性的产生大量EPSI和其他致病因子。但在植物体内,菌体细胞被限制或聚集于如根皮层细胞间隙、内皮层、木质部导管和纹孔膜等障碍结构之处,3-羟基棕榈酸甲基酯于是因浓度积累而超过上述门槛,激活PhcA,后者调节产生EPSI和细胞壁降解酶类以利病菌穿透结构障碍而进一步的扩散。当然缺乏3-羟基棕榈酸甲基酯并非杜绝PhcA的产生,但确实大大降低了PhcA蛋白浓度。
不过,关于3-羟基棕榈酸甲基酯信号是如何传递激活Phc调节子的转录并最终产生PhcA,目前还不清楚。而PhcA可直接与egl起动子结合以激活其转录。eps起动子的转录激活则是间接的通过PhcA达到的,即PhcA首先结合并激活一中间调节物(xpsR)的起动子,然后其产物XpsR与VsrB/VsrC双成分系统一道激活eps转录(Huang et al., 1998)。
PhcA对PglA或Pme的激活和控制也不是直接的,因为它不与上述两者的起动子结合。PhcA对PglA的控制通过PehS/PehR双成分系统来达到(Allen et al., 1997)。如果PehS关联信号存在,PehS将磷酸化PehR并直接刺激或通过这中间物激活PglA的转录。而当3-羟基棕榈酸甲基酯很丰富时,PehSR(与PglA对应)的表达则被PhcA压抑。与此类似,青枯菌一些涉及运动性的基因也被PhcA系统抑制,而被PehS /PehR激活(Allen et al., 1997; Clough et al., 1997)。因此,用于调节PglA表达和细菌运动性的机制和组成成分可能是一致或重叠的,对此二者的协同性控制有利于病原细菌在病害发生的早期移动通过植物果胶质较多的细胞间隙地区,而当后期细菌细胞拥挤于木质部导管后,这一机制则被关闭。细菌密度增高时,似乎也表明了基质营养的丰富性,因而运动已不太必要,帮助细菌从基质获取营养的Ⅲ型Hrp分泌系统也受到PhcA系统的抑制(Schell, 2000)。由此可见,PhcA对果胶分解酶的控制与对EPSI及EG的调节是方向相反的2个过程。
5 讨论综上所述, 青枯菌对寄主植物从接触、侵入、定殖到最后的扩展并引起枯萎是一个相当复杂的过程,一些研究显示病原细菌与寄主根部表面的接触可能涉及到相互识别,识别的机制涉及植物外源凝集素和细菌LPS, 但另外一些证据则表明细菌对植物根部的吸附和进入在很大程度上是非特异性的。因此寄主与病原之间的初始接触与识别及其与随后病害的发生之间的关系还有待作进一步研究。在无人为伤口的条件下,细菌进入植物的途径主要是自然孔口和裂痕,这个过程中,细菌的运动性和果胶酶产物可能起着重要作用。
当青枯菌侵入根部后,它早期在皮层组织及维管束以外的增殖和后期进入木质部导管并在导管内的增殖扩散构成了侵染成功的2个重要阶段。前一个阶段是后一阶段的必要准备,尤其在自然条件下,因为不是靠人工注射菌液直接进入茎干或制造伤口将根部直接暴露于接种菌液,细菌从根表侵入,通过皮层组织最后达到维管束,是致病和枯萎得以发生的一个重要前提。在这个阶段,细菌增殖积累,产生大量的3-羟基棕榈酸甲基酯,诱发启动Phc A系统制造大量致病因子如EPSI和纤维素酶等,从而带动细菌穿越内皮层障碍进入木质部导管。
然而病菌并非只要入侵导管分子就必定能导致枯萎的发生,病菌的致萎过程是伴随着细菌在输水组织内的大量增殖、移动及扩散,堵塞和或损坏导管及相邻组织而发生的。一些植物品种的抗病机制也在于将病菌限制于局部区域(Nakado et al., 2000)。广泛而又大量的病原细菌的物质存在是引起枯萎所必要的,虽然枯萎并不仅是由病菌个体的机械堵塞引起,但无论是胞外多糖与胞外酶其分泌都依赖于细菌菌体。也许在人工条件下将含致病因子细菌过滤液导入植物导管也可引起类似的枯萎症状,但在自然条件下没有相应的大量细菌侵入,要获得如此高浓度的致病物质是不可能的。EPSI在致萎过程中起着重要作用,除了作用植物组织外,还行使协助细菌本身的移动、定殖和保护病菌免受植物防御袭击的功能。
青枯菌存在着2种生活形态,即寄生与腐生。在长期的进化过程中,细菌发展出了一套自动基因毒性调节系统,即由3-羟基棕榈酸甲基酯引发的PhcA系统。这一系统的特征是由细菌密度或拥挤度调节毒性物质的的产生及产生种类,使细菌在需要的时候产生合适的致病因子。关于这一系统的基因、基因产物及其功能以及与之相关联的Ⅲ型Hrp表现型转换分泌系统近年来有不少研究;不断揭示出来的结果显示,青枯菌的致病机制及其调控远比人们最初想象的要复杂和精妙。只有通过对青枯病菌致病机制的更深入地研究,才有可能找到控制它的有效方法。
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