1983年首例转基因作物的问世为人们提供了一种新的育种方法，可将有益基因转入植物而不会改变原有品种的优良性状。抗生素或除草剂筛选是植物转基因的常规步骤。但是，抗生素或除草剂等药物对植株转化有较大影响，会影响转化细胞的生长及再生，并抑制不定根再生(刘凡等，1993)；其次，标记基因的安全性从一开始就受到了广泛争论。人们担心在转基因作物的商品化种植过程中，其中的除草剂抗性基因可能经自然杂交，而抗生素基因可能通过转染肠道细菌，从而造成自然界的非转基因作物对除草剂、人类对抗生素产生抗性(Dale，1999；Kuiper et al., 2001)。虽然也有不少手段可以去除转基因植物中的标记基因(Scuu et al., 2002)，但大多效率不高，或者需要进行子代杂交，这对木本植物来说不是十分现实。针对抗性筛选对转化及再生的不利影响，人们试图不采用抗性筛选而直接根据报告基因的表达获取再生植株，但也存在转化效率低、转基因沉默等问题(Dominguez et al., 2002)，因而应用不是十分广泛。

近年来，人们开始采用一种新型的正筛选方法——甘露糖筛选体系。该体系以大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase，PMI)基因为标记基因，甘露糖为筛选剂进行筛选。目前，PMI/甘露糖筛选体系已成功用于甜菜(Beta vulgaris)(Joersbo et al., 1998；2000)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Todd et al., 2001)、玉米(Zea mays)(Negrotto et al., 2000；Wang et al., 2000；Wright et al., 2001)、小麦(Triticum aestivum)(Wright et al., 2001)、水稻(Oryza sativa)(Lucca et al., 2001)、木薯(Manihot esculenta)(Zhang et al., 2000a；2000b)等植物；在木本植物甜橙(Citrus sinensis)(Boscariol et al., 2003)和葡萄(Vitis vinifera )(Reustle et al., 2003)等上也有报道。本文主要就PMI基因的作用及原理、影响因素、在木本植物转基因中的应用、检测方法和安全评估等方面对PMI/甘露糖筛选体系进行介绍。

1 PMI基因的作用及原理

自然界中的植物大都没有PMI基因[肉桂(Cinnamomum cassia)和一些豆类除外](Lee et al., 1984)，但它在植物以外的生物界却广泛存在，人们已从细菌、酵母、动物及人体中都分离到该基因，并获得纯化蛋白。如图 1所示，在上述生物以及PMI转基因植物中，甘露糖经己糖激酶磷酸化生成的甘露糖-6-磷酸，在PMI的异构作用下生成果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸再进入糖酵解途径(Reed et al., 2001)。

在甘露糖筛选培养基上，转化与未转化植物细胞中的己糖激酶均能不断将甘露糖转变成为甘露糖-6-磷酸，但只有在转化细胞中PMI的进一步催化下才能转化成果糖-6-磷酸，继而进入糖酵解途径而被细胞利用，因此转基因细胞可以利用甘露糖作为碳源而正常生长和再生；而非转化细胞由于没有PMI基因，不能将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸，因而不能利用甘露糖作为碳源，且造成体内甘露糖-6-磷酸的积累，抑制糖酵解(Reed et al., 2001)，并导致ATP新陈代谢受阻和磷酸根离子的大量消耗，从而生长受到抑制(Joersbo et al., 1999)。该选择体系与抗生素或除草剂筛选体系的区别在于抗生素和除草剂直接“杀死”未转化植物细胞，而甘露糖选择体系中的未转化细胞尽管处于“碳饥饿”状态，但不会立即死亡。在该筛选体系中，转化细胞的生长和再生过程可以利用筛选剂甘露糖，因而被称为正筛选。

2 影响甘露糖筛选体系转化效率的因素

甘露糖筛选体系转化效率高于卡那霉素选择体系(Lucca et al., 2001)，在金柑(Fortunella crassifolia)上的试验也获得同样结果。但是，由于该体系依赖甘露糖-6-磷酸这一不参与代谢且对植物生长有毒害作用的己糖的积累以及ATP和磷酸根离子的无效消耗而实现筛选作用，从而容易受培养基或外植体内其他糖类水平等生理因素的干扰，导致甘露糖筛选的敏感性降低。Joersbo等(1999)研究发现选择培养基中碳源的性质和浓度以及磷酸根离子浓度成为制约转化效率的关键因子，而基因型和光密度等对筛选体系的影响较小。

2.1 葡萄糖等糖对甘露糖筛选体系的影响

在甘露糖筛选体系中，当葡萄糖的浓度高出甘露糖浓度15~25倍时，就可以完全拮抗甘露糖对甜菜细胞生长的毒害作用(Joersbo et al., 1999)。果糖也会削弱甘露糖的致毒能力，但不如葡萄糖有效，这可能是因为葡萄糖和甘露糖都是经己糖激酶磷酸化，而果糖却是由果糖激酶催化磷酸化，因而果糖不能有效地阻止己糖激酶与甘露糖结合并催化转化。麦芽糖对解除甘露糖毒害作用的能力与果糖相近，而蔗糖的效应弱于葡萄糖，但强于果糖及麦芽糖(Joersbo et al., 1999)。

果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖对甘露糖筛选体系中甜菜转化效率的影响十分明显(Joersbo et al., 1999)。4种糖的加入均可提高转化效率，其中加入适量蔗糖可使转化效率提高10倍以上，麦芽糖的效应次之，再次是葡萄糖和果糖。然而，Boscariol等(2003)以甜橙为试材研究发现：在只以甘露糖为碳源的培养基上即可获得较高的转化率，加入适量蔗糖虽可提高部分品种的转化率，但幅度并不是很大(仅约30%)。在甘露糖筛选培养基中加入其他己糖或蔗糖对于筛选效率有不利影响，这在甜菜(Joersbo et al., 1999)和甜橙(Boscariol et al .，2003)上表现一致。Joersbo等(1999)认为，甘露糖筛选体系的转化效率主要取决于选择压力的大小，并建议在选择初期，加入的选择压要能保证20%~30%的外植体能够再生芽。

2.2 磷酸根离子浓度对转化体系的影响

甘露糖与磷酸根离子的相互作用被认为是甘露糖产生致毒作用的机制之一。Joersbo等(1999)报道高浓度的磷酸根离子能够减轻甘露糖对甜菜细胞的致毒力，培养基中磷酸根离子浓度与转化率呈显著正相关，这可能是由于植物细胞快速吸收甘露糖，在己糖激酶的作用下短时间积累大量甘露糖-6-磷酸并消耗大量ATP。因此，PMI转基因细胞或芽即使能够将甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸，仍有可能发生不同程度的磷酸根离子缺乏。适度磷酸根离子缺乏会引起植物组织产生一系列的应激反应。Malboobi等(1997)发现磷酸根离子不足会诱导拟南芥组织产生β-葡萄糖苷酶，而β-葡萄糖苷酶能够水解处于非活化状态的细胞分裂素糖苷从而促进生长。那么，如果PMI转化植株中磷酸根离子不足，转化细胞或组织也可能诱导产生β-葡萄糖苷酶，从而刺激生长和再生，这可能就是甘露糖筛选体系的转化率和再生率高出卡那霉素等抗生素筛选体系许多倍的原因(Joersbo et al., 1998)。

2.3 其他因素对转化效率的影响

众所周知，光照条件也会影响植物细胞中碳水化合物和ATP的水平。Joersbo等(1999)研究发现，提高光照强度可以减轻甘露糖对植物生长的抑制；但同时也发现不管培养基中是否添加甘露糖，提高光照强度都可促进植物生长，并提高转化率1.7倍。这说明光照条件与甘露糖的致毒能力之间没有必然的相关性。

基因型对转化效率也有影响。Joersbo等(1999)认为他们建立的甘露糖筛选体系可适用于非常广泛的甜菜基因型，但根据Boscariol等(2003)对不同甜橙品种的试验表明，不同基因型之间甘露糖的使用浓度也应作相应的调整。

3 甘露糖筛选体系在木本植物转基因中的应用

以大肠杆菌PMI为筛选基因，甘露糖为筛选剂的植物转基因筛选体系最早由Joersbo小组用于甜菜转基因，并于1998年报道了首例PMI转基因甜菜(Joersbo et al., 1998)，随后对影响转化效率的因素作了大量的研究(Joersbo et al., 2000；Todd et al., 2001)。虽然PMI/甘露糖筛选体系研究历史较短，仅有部分植物采用了该体系，但有由模式植物向经济作物发展的趋势。对一些难生根的作物，尤其是木本植物，采用传统的抗生素或除草剂等筛选方法获得的转基因芽再生根相当困难，而甘露糖筛选对转基因芽生根能力的抑制要轻得多(Boscariol et al., 2003)。

近来，巴西的Boscariol等(2003)用带有PMI基因的农杆菌EHA101盛染Pera、Valencia、Natal和Hamlin 4种甜橙实生苗上胚轴，以73、73、84.2及112.3 mmol·L^-1甘露糖为碳源和筛选剂，在16/8 h光/暗培养条件下直接再生芽，其转化率在3%~23.8%之间，表明PMI/甘露糖筛选体系十分有效。然而，Reustle等(2003)研究表明甘露糖筛选体系在葡萄转基因上效果不是很理想，非转基因抗性芽比例很高，转基因愈伤组织也多为嵌合体。这可能与他们未能调整好最佳的甘露糖和蔗糖比例有关。

笔者在金柑上的研究表明，当培养基中加入7.9 g·L^-1甘露糖和15 g·L^-1蔗糖(二者等摩尔浓度)作为筛选剂时，平均每个上胚轴外植体约再生出2个不定芽，比卡那霉素筛选时约高出100倍，检测表明，有10%~30%左右的抗性芽属于转基因芽，与卡那霉素筛选体系相近。来自2种筛选体系的转基因芽的生根能力差异比较研究正在进行。

4 PMI转基因植株的检测

由于PMI基因不存在于大多数植物体内，转PMI基因的植株可以采用常规的转基因检测方法如PCR、RT-PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western杂交等方法进行检测。此外，PMI基因编码的蛋白是一种酶，因此，检测酶活性的一些方法也可用于转基因PMI植株的检测。

4.1 氯酚红(chlorophenol red，CPR)法

该方法基于甘露糖代谢时可使培养基酸化的原理。pH指示剂氯酚红在pH6.0时呈红色，随着pH下降转变成黄色。将待测组织小块接种到添加甘露糖和氯酚红的MS液体培养基中，在黑暗条件下，25~30 ℃培养4~5 d后，如培养基仍呈红色或紫色，说明没有PMI活性，该材料为非转基因材料；如培养基呈黄色或桔红色，则说明PMI基因成功导入了外植体。与GUS组织染色相比，PMI活性检测无需昂贵试剂，干扰反应少，结果可靠。该方法已成为PMI活性检测的最常用方法，在转基因甜菜(Joersbo et al., 1998)、玉米(Wright et al., 2001)、小麦(Wright et al., 2001)、水稻(Lucca et al., 2001)和甜橙(Boscariol et al., 2003)上均已有应用。

4.2 分光光度计检测法

PMI催化甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸的同时会将NADP⁺还原成NADPH，而NADPH的增加会造成340 nm处的吸光度上升(Van Schaftingen et al., 1995)。因而，用分光光度计检测340 nm处NADPH吸收值的上升速度，就可以检测PMI活性。从非转基因植株如甜橙和玉米中没有检测到PMI活性，而在转基因甜橙(Boscariol et al., 2003)和玉米(Wang et al.，2000)中则检测到PMI活性。

4.3 蛋白质电泳及染色

利用蛋白质电泳及染色检测PMI的原理与分光光度计检测法相似，PMI催化甘露糖-6-磷酸转化成果糖-6-磷酸的同时会将NADP⁺还原成NADPH，NADPH又可将其电子转移给电子传递剂吩嗪硫酸甲酯(PMS)，还原态的电子传递剂可直接还原噻唑蓝(MTT)，生成深蓝色的不溶于水的甲NFDA3 (formazan)(Gibon et al., 2001)，在凝胶上显现条带。因此，待测组织的蛋白经电泳和染色后，如果有蓝带出现，则说明PMI基因导入外植体；反之，表明转基因不成功。该方法已成功应用在转基因甜橙的检测上(Boscariol et al., 2003)。

5 PMI/甘露糖筛选体系的生物安全评估

对一种筛选体系进行生物安全评估主要是对标记或筛选基因所编码的蛋白进行过敏性分析、毒性检测、农业性状分析以及与食物中其他成分相互作用分析。Reed等(2001)对转基因玉米和甜菜中PMI基因所编码的蛋白质进行了全面的分析，认为甘露糖筛选体系对人体健康和环境十分安全。

Reed等(2001)从生物信息学、体外消化和糖蛋白类型等方面进行分析和检测，结果显示：大肠杆菌PMI基因与任何已知的毒素或过敏原没有显著的同源性；转基因植物表达产生的P MI蛋白能在胃和小肠环境中完全分解。

给13只小鼠喂养含过量PMI蛋白的食物，连续观察14 d，结果表明小鼠没有中毒表现，与对照组相比也无异常情况出现，说明PMI蛋白没有毒性。对1998年移栽到大田的PMI转基因玉米和非转基因玉米进行含水量、植物群落、茎杆硬度、根长、株高和穗长等一系列农艺性状进行了全面研究，没有发现显著区别，说明PMI基因对植株的生长或其他农艺性状没有负面影响，对环境也是安全的。对转基因玉米与非转基因玉米进行纤维、油脂、蛋白质、淀粉、β-胡萝卜素和玉米黄质等营养指标的分析表明二者之间也无显著区别。

6 结语

综上所述，PMI/甘露糖筛选体系自1998年首次报道用于甜菜转基因以来，已在不少单子叶植物和双子叶植物上取得成功。这一新的筛选基因，为植物转化提供了不用除草剂基因或抗生素基因来筛选转化植株的新途径，将对植物转基因领域产生巨大的推动作用。且该系统对人体和环境安全、筛选试剂价格低廉、不影响转化植株的生长发育、筛选效率高，因此有望部分代替抗生素或除草剂等传统筛选体系，在植物的遗传转化过程中得到更广泛的应用，成为植物转基因中的又一有效筛选体系。

但是，肉桂和一些豆类植物由于具有内源PMI活性，因而该筛选体系在这些植物上不能应用，对于以往研究尚未涉及过的材料，需先对内源PMI活性进行检测。另外，作为一种新的筛选体系，它在植物，尤其是木本植物上的应用尚十分有限，因而对包括葡萄在内的多数植物，尚有必要对筛选培养基中甘露糖与其他糖以及磷酸根离子浓度等因素进行进一步的优化，同时还必须考虑基因型对转化的影响。

笔者目前正在开展PMI基因转化金柑的研究，根据初步试验结果，发现金柑不能利用甘露糖，因而具备应用该筛选体系的前提条件。与卡那霉素筛选体系相比，采用甘露糖筛选体系可以获得较多的转基因芽，而且转基因芽的生长势较强。PMI转基因组织块的氯酚红检测法所需试剂价格低廉，操作十分简单，干扰少。本研究小组现已将转基因芽转移到生根培养基中进行生根，后续研究正在进行。