银杏(Ginkgo biloba)是我国特有树种，我国劳动人民自古就有栽植银杏的习惯。在长期栽培过程中，已逐渐形成了一些农家品种。由于品种间形态差异(非果期)较小，用常规方法无法鉴别各个品种，特别是早期(苗期)鉴定。20世纪90年代以来，DNA分子标记技术的不断发展和完善，为品种鉴定提供了新的技术手段，如RAPD、AFLP、ISSR、SSR等。这些标记也逐步被用于植物种或品种的鉴定研究，如RAPD标记鉴定桂花(Osmanthus fragrans)品种(赵小兰等，1999)、AFLP标记鉴定苹果(Malus pumila)品种(祝军等，2000)和美洲黑杨(Populus deltoides)无性系(尹佟明等，1998)等。本文利用ISSR DNA标记，分析我国银杏主要栽培品种ISSR标记的多态性，寻找这些品种的鉴定指纹。

1 材料与方法 1.1 试验样品采集

样品的冬芽采于江苏省邳州市国家林业局银杏种质资源收集圃。共采集13个优良品种：1)泰兴2号；2)尖顶佛手；3)龙眼；4)叶子银杏；5)金坠子；6)洞庭皇；7)梅核；8)鸭尾；9)邳州曹2号；10)邳州亚甜；11)泰兴1号；12)邳州芋香；13)小圆子。DNA的提取采用沈永宝等(2001)方法。

1.2 PCR扩增

PCR扩增在PE9600基因扩增仪上进行。优化的PCR扩增条件：94 ℃预变性2 min后进入35个循环，每个循环94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min。所有循环完成后延伸7 min，最后于4 ℃保存。优化的反应体系：总反应体积20 μL，其中5 ng左右模板DNA；10 pmol引物；dNTP量各为100 μmol·L^-1，2 μL 10×反应缓冲液[100 μmol·L^-1 Tris-HCl (pH 8.3)，500 μmol·L -1 KCl，2.0 mmol·L^-1 MgCl₂，0.01%明胶，5.0 g·L^-1 BSA ]，1 U Tag DNA聚合酶；扩增产物在2%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳分离，最后在紫外灯下用Polaroid摄像系统记录结果。

1.3 ISSR引物

试验使用的100条ISSR引物购自上海生物技术工程公司。

2 结果

通过对100条ISSR引物的筛选，最终筛选出5条产物清晰、多态性高的引物用于13个银杏品种的PCR扩增。ISSR3：ACACACACACACACACTT；ISSR44：ACACACACACACACACGA；ISSR46：ACACACACACACACA CGG；ISSR67：TCTCTCTCTCTCTCCC；ISSR75：AGTGAGTGAGTGAGTG。

5个引物共扩增多态性位点38个。图 1和图 2分别是引物ISSR46和ISSR44对13个银杏品种的扩增结果。从图 1可看出，供扩增多态性片段7条，不同品种多态性片段差异较大。有些品种间区别比较明显，具有特异性片段，如片段ISSR46-550 bp为2号样品(尖顶佛手)特有；ISSR46-670 bp为13号(小圆子)特有。结合引物ISSR44扩增出的4条多态性片段ISSR44 -580 bp、ISSR44-520 bp、ISSR44-660 bp、ISSR44-1750 bp，借鉴于常规植物分类方法，根据各品种某一多态性片段的有或无，编制13个银杏品种检索表:

1.有ISSR46-550 bp片段………………………………………………2(尖顶佛手Jiandingfoshou)

1.无ISSR46-550 bp片段………………………………………………1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13

    2.有ISSR46-670 bp片段…………………………………………13(小圆子Xiaoyuanzi)

    2.无ISSR46-670 bp片段…………………………………………1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12

      3.有ISSR46-740 bp片段……………………………………4、9

        4.有ISSR46-1600 bp片段………………………………9(邳州曹2号No.2 of Pizhoucao)

        4.无ISSR46-1600 bp片段………………………………4(叶子银杏Yeziyinxing)

     3.无ISSR46-740 bp片段……………………………………1、3、5、6、7、8、10、11、12

        4.有ISSR46-1159 bp片段…………………………………7(梅核Meihe)

        4.无ISSR46-1159 bp片段…………………………………1、3、5、6、8、10、11、12

           5.有ISSR46-1350 bp片段………………………………11(泰兴1号No.1 of Taixing)

           5.无ISSR46-1350 bp片段………………………………1、3、5、6、8、10、12

              6.无ISSR46-1000 bp片段…………………………1、10

                7.有ISSR44-580 bp…………………………1(泰兴2号No.2 of Taixing)

                7.无ISSR44-580 bp…………………………10(邳州亚甜Pizhouyatian)

              6.有ISSR46-1000 bp片段………………………………3、5、6、8、12

                7.有ISSR44-660 bp片段…………………………5(金坠子Jinzhuizi)

                7.无ISSR44-660 bp片段…………………………3、6、8、12

                  8.无ISSR44-580 bp片段…………………………12(邳州芋香，Pizhouyuxiang)

                  8.有ISSR44-580 bp片段…………………………3、6、8

                    9.有ISSR44-1750 bp片段……………………3、6

                      10.有ISSR44-520 bp片段…………………6(洞庭皇Dongtinghuang)

                      10.无ISSR44-520 bp片段…………………3(龙眼Longyan)

                    9.无ISSR44-1750 bp片段………………………8(鸭尾Yawei)

根据以上检索表，可逐步鉴别这些品种。当然这种方法对于少数品种鉴定较为直观，简单易行。

3 讨论

简单序列重复区间扩增多态性(inter_simple sequence repeat，ISSR)是一种新型DNA分子标记技术(Zietkiewicz，1994)。它是根据基因组内广泛存在的微卫星基序设计单一引物，对基因组DNA进行扩增，扩增的指纹图同时提供基因组内多个位点序列信息。ISSR标记结合了SSR标记技术和RAPD标记技术的特点，除了根据微卫星区域设计引物和PCR的退火温度比RAPD高外，与RAPD标记的检测过程基本一致。由于ISSR引物长度在15~ 24 bp左右，PCR反应的退火温度较高，引物-模板复合物比较稳定等因素，表现出较好稳定性。钱韦等(2000)和Jonsson等(1996)的研究也认为ISSR的稳定性明显优于RAPD，保持了微卫星标记的特点。杜生明(1999)¹⁾比较RAPD标记和ISSR标记对美洲黑杨和欧美杨(Populus euramericana)基因组的分析，有扩增产物的ISSR引物90%以上能检测到分离位点，可靠性更高。不过退火温度与ISSR指纹的稳定性至关重要。退火温度不仅影响指纹的丰富度，而且直接影响指纹的识别。在较低的退火温度下增加了非特异扩增的可能，导致一些假带的产生(Sanchez et al., 1996)。在本试验过程中也同样发现这一现象。

1) 杜生明.1999.美洲黑杨和欧美杨分子标记连锁图谱构建及其重要性状相关基因定位研究.南京林业大学博士论文

与微卫星(SSR)相比，ISSR不要求已知基因组序列信息，大大减少多态分析的前期工作，引物具有广泛的通用性。尽管ISSR是一种显性遗传标记，不能检测显性纯合基因型和杂合基因型，但作为种或品种鉴定的分子标记，并不受其影响。本文的研究发现ISSR标记能更好揭示品种间的差异，仅用2个ISSR引物就能区分13个银杏品种，鉴定效率和稳定性也明显优于RAPD标记。

由于本文鉴别的银杏品种只有13个，通过类似于植物常规分类方法，编制各个品种的指纹检索表。由于每个引物扩增多态位点的数量和特异性不同，选择哪个引物扩增结果作为检索表的起始点，存在很大人为因素。不同分析者使用同样资料，编制的检索表可能不同，不过，最终都能达到鉴别目的。此外，当品种数量较多时，由于所牵扯多态性位点多，编制检索表的方法很难有效，只有通过建立数据指纹图谱，进行聚类分析，才能达到鉴别各品种的目的。

就品种鉴定而言，包含2个层面：一是鉴定已知特定材料的真实性，另一是鉴定未知材料。本文所研究的13个银杏品种的ISSR指纹，只能用于已知特定材料的真实性鉴定，即鉴定某一已知特定品种的可靠性(比较鉴定)。如果待鉴定品种不属于这13个品种之一，也无法进行鉴定。对未知材料的鉴定是极其困难的，有时根本无法做到。只有不断扩大研究品种的数量来增加对未知品种鉴定的可能性。