遗传图谱是现代分子数量遗传学研究的一个基本平台，在过去的十几年中，林木遗传学家在几十个树种中构建了分子标记连锁图谱，并进行了一些重要数量性状的QTL分析。(Bradshaw et al., 1994; Cevera et al., 2001; Devey et al., 1994; Echt et al., 1997; Grattapaglia et al., 1994; Mukai et al., 1995; Nelson et al., 1993; Plomion et al., 1995; Remington et al., 1999; Wu et al., 2000; Yin et al., 2003)。可是林木中大部分的遗传图谱是利用匿名的显性标记构建的，如RAPD标记和AFLP标记等。近几年来才有一些在松树(Temesgen et al., 2001)和杨树(Cervera et al., 2001; Yin et al., 2004)中利用高保守性的共显性标记进行遗传图谱构建的报道，尽管利用随机匿名标记可以快速建成某一个杂交组合的遗传图谱，但所获得的信息是零散的，而且往往具有杂交组合特异性，因而无法进行基因组比较(Yin et al., 2003)。

林木是一个处在初级改良阶段的物种，其遗传改良程序与作物及牲畜等以品系为改良对象的育种程序有所不同，杂交组合特异性的遗传信息在实际的育种程序应用中有很大的局限性。要确定一个检测到的QTL能否应用到实际改良程序中，首先需要测定它在其他杂交组合中是否稳定。因此在实际改良过程中，人们感兴趣的是那些在不同遗传背景下都表达的“通用”QTL (Lerceteau et al., 2000)。然而在林木中由于遗传组成的复杂性及缺少有效的标记系统，很难将遗传背景的效应分离出来。而且利用随机匿名标记很难在天然群体水平上找到与某一QTL显著相关的分子标记(Strauss et al., 1992)。在林木天然群体进化历程中，由于标记与QTL间重组的不断发生，在不同世代及不同个体间，标记与QTL间的相关可能会丧失。因此分子标记辅助选择育种在林木实际育种程序中应用的可操作性越来越受到林木经典育种学家的质疑。

随着林木基因组研究的进展，人们具有了解决上述问题的方法。可以利用与性状表达有关的基因本身发展分子标记，这样就可以避免在群体水平上由于标记与目的基因间连锁不平衡消失带来的问题，从而使在林木群体水平上开展标记辅助选择具有可行性(Strauss et al., 1992)。目前大规模的EST(Expressed Sequenc Tag, 表达序列标签)测序计划已在松树(http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/Pine/index.html)(Temesgen et al., 2001)和杨树(http://www.biochem.kth.se/PopulusDB)(Sterky et al., 1998)中展开。EST标记可以作为图谱比较及在不同群体中获得的QTL信息比较的桥梁。为进行有效的EST图谱构建，需要有高效且成本低廉的检测技术。EST标记的开发主要是基于导致点突变的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)。目前有6种主要的方法可用于点突变检测：单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism，SSCP)电泳技术、DNA化学切割(chemical cleavage，CCM)、RNA酶非匹配切割(RNase mismatch cleavage)、利用水溶性碳二酰亚胺(carbondiimide，CDI)与DNA杂合链(DNA heteroduplexes)反应、序列测定和变性凝胶梯度电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)(Andersen et al., 1998; Bui et al., 2002; Cotton, 1993; Economou et al., 1992; Ellis et al., 1998; Faudoa et al., 2000; Grange et al., 1990; Liu et al., 1999; Marshall et al., 1997; Hayashi, 1991; Krizkova et al., 1994)。在这6种技术中，尽管SSCP及DGGE检测技术不能获得准确的突变碱基及位置信息，但这2种技术都是分离野生型和突变型DNA及RNA PCR产物的非常敏感的方法，对区分含有单核苷酸突变的等位基因十分有效，而且都适合于大量样品的分析，因此是EST作图的常用分析方法。目前已有全自动化仪器用于完成这2种分析，但是仪器价格较为昂贵。由于DGGE分析中灌制梯度凝胶人工操作较难，因而SSCP就成了更简单和成本低的技术选择。本文的目的之一是对针叶树分析的SSCP检测实验程序进行优化，同时对EST标记在松属不同树种间的通用性进行检测。在此基础上，对马尾松转录图谱构建的更有效策略进行了探讨。

试验所用材料马尾松(Pinus massoniana)来自于安徽黄山，利用单株树上的针叶和种子提取DNA(由南京林业大学南方林木种子中心李淑娴同志提供)。其中一份DNA模板是由二倍体针叶组织中提取的，另有24份DNA样品是从种子的单倍体胚乳组织中提取的。DNA的提取采用了植物DNA提取试剂盒(DNeasy Plant Mini Kit，Qiagen)并按试剂盒提供的实验程序提取，从叶和种子中提取的DNA最后分别溶解在50 μL和100 μL TE缓冲液中。

选用了5个在其他松属树种中开发的EST引物(Plomion et al., 1999)，这些EST对应的基因功能已知或其功能可以根据与其他物种基因的序列相似性推知。这几个基因(表 1)分别是：苯丙烯醇脱氢酶(cinnamyl-alcohol dehydrogenase，AD)基因，该基因在木素合成代谢过程中起重要作用¹⁾；查尔酮合酶(chalcome synthase，CHS)基因，该基因编码类黄酮和联苯乙烯生物合成过程中的关键酶；亚硝酸盐降解酶(nitrite reductase，NIR)基因，该基因编码2种亚硝酸盐降解酶中的一种酶，其功能是将亚硝酸盐降解为氨盐(Neininger et al., 1994)；ARA554为在火炬松(P.taeda)木质部中差异表达的cDNA，这个cDNA的序列与编码阿拉伯半乳糖苷酶的基因有很高的相似性(Loopstra et al., 1995)；谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)基因，这个基因编码的酶催化一个ATP依赖型的反应，可将氨盐基团和谷氨酸合成谷氨酰胺(Plomion et al., 1999)。

表 1 所用引物及针对不同基因的PCR扩增反应优化条件^① Tab.1 Description of primers and optimal PCR conditions used for specific amplification of different genes

表 1 所用引物及针对不同基因的PCR扩增反应优化条件① Tab.1 Description of primers and optimal PCR conditions used for specific amplification of different genes

1) McKay J J. A mutation in lignin biosynthesis in loblolly pine:genetic, molecular and biochemical analyses. Ph.D.Thesis, North Carolina State University, Raleigh, NC, 1996:144

PCR扩增反应中利用了20~50 ng的DNA模板，反应总体积为15 μL，反应体系中含有终浓度为0.1 pmol的正、反向引物，1×PCR反应缓冲液(Gibco BRL)，100~300 μmol的MgCl₂(浓度随不同基因变化)，200 μmol dNTPs和1.0 U Taq DNA聚合酶(Gibco BRL)。扩增反应在PE-9700热循环仪上进行，程序如下：94 ℃变性3 min，然后进行20个梯度变温循环，梯度变温循环中的第一个循环的退火温度比最终确定的特异退火温度高2.0 ℃，在随后的梯度变温循环中，每一循环退火温度降低0.1 ℃，20个循环后，在恒定的特异退火温度下再进行10个循环的反应。这些循环的退火时间为45 s，变性条件为94 ℃ 30 s，延伸条件为72 ℃ 1 min 30 s。最终特异退火温度的测试范围在45~65 ℃之间。循环结束后，最后在72 ℃下保温10 min。在SSCP分析前，利用1.0 μL PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳并进行溴化乙锭染色检测。

SSCP分析参照Plomion等(1999)的方法进行并做了适当调整，将1 μL PCR反应产物与10 μL上样缓冲液(95%去离子甲酰胺, 10 mmol氢氧化钠, 0.05%二甲苯，0.05%溴酚蓝)混合, 然后在95 ℃下变性5 min并迅速在冰上冷却。单链片段在非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离[0.5×MDE (Mutation Detection Enhancement gel, BMA)]。电泳在220 V电压下、0.6×TBE缓冲液中持续16~24 h(随片段大小而异)，并对不同的电泳温度进行测试。电泳结束后，凝胶的银染检测按以下步骤进行：1)在含有10%乙醇和1%乙酸的固定液中固定2次，每次7 min；2)用去离子水清洗3次；3)在0.15%的硝酸银中染色30~60 min；4)用去离子水清洗1次；5)在含有1.5 g氢氧化钠、1%甲醛的100 mL显色液中显色，这一步骤大约需要5~15 min；6)用去离子水清洗2次并将凝胶存放在含有6%甘油、40%乙醇及54%去离子水的固定液中。最后利用佳能G2数码相机进行凝胶拍摄。

通过SSCP电泳片段在二倍体针叶和单倍体胚乳组织中的比对，分别进行了等位基因的记录，利用χ²检验对观测到的等位基因的分离是否符合孟德尔比进行了检测。理论上，由于变性不完全及某些片段可能有相同的电泳迁移率，一般在单倍体组织中可能观测到1~3条SSCP片段，而在二倍体组织中可能观测到2~6条片段。与群体分析不同的是，对家系材料进行分析时，可以根据等位基因在家系子代中的分离情况从复杂的带型中清晰地识别等位基因。

在对本研究选择的测试基因分析中，根据Plomion等(1999)提供的实验条件，没能获得理想的扩增产物。因此首先对PCR扩增反应的条件进行了优化，主要对模板浓度、镁离子浓度、退火温度及反应缓冲液的成份进行了测试。针对每一基因的最优反应条件列在表 1中。在PCR反应程序中加入了梯度变温循环以提高扩增反应的特异性。

在这5个选出的基因中，ARA554和GS在任何尝试的反应条件下，都不能在马尾松中获得扩增产物。因此认为在马尾松中，这2个基因在引物的接合域可能发生了碱基突变。由于EST引物序列在种内不同个体间是高度保守的，所以扩增失败不应是取样导致的。因此要在马尾松中分析这2个基因，需要根据基因不同位置的序列重新设计引物。其他3个基因都在马尾松中成功地扩增。扩增片段的大小与期望片段大小相近(图 1)。因此，与基因来源物种相比，马尾松中对应基因没有因插入或缺失而导致长度的明显变化。

图 1 CHS基因PCR产物的琼脂糖凝胶检测 Fig. 1 Detection of the PCR products of CHS in argarose gel CHS PCR扩增产物的大小约为370 bp，与期望片段大小相似，在琼脂糖凝胶上未检测到多态性。M为标准分子量；F为扩增失败的样品；1为从针叶组织提取的DNA模板；2~19为从种子胚乳组织中提取的DNA模板；带箭头的数字100~600是以碱基数为单位的对应片段的分子量。 The size of PCR product of CHS is estimated at about 370 bp, approximately in the similar size as expected and no polymorphism could be identified.M is the molecular weight standard; F stands for the sample failed in amplification; 1 is the DNA extracted from needles of the seeding tree; 2~19 are DNAs isolated from the megagametophytes of seeds from the same tree; 100~600 with arrows are the molecular standard in base pairs.

通过SSCP分析发现，CAD和NIR基因在分析的个体中纯合，因此在种子胚乳组织中不发生分离。CHS在SSCP带谱上，在二倍体组织中共产生了4条谱带，这4条谱带分别代表了2个杂合等位基因的4条DNA单链。这4条单链在胚乳组织中形成2组分离的谱带，分别对应2个不同的等位基因(图 2)。χ²分析发现，该基因的分离比率符合孟德尔分离比(χ²=0.22, < 3.84，p=0.05)。因此，在检测的5个基因中有3个(60%)引物在马尾松中通用，扩增出的基因位点中，只有一个(20%)引物位点杂合。这与基于随机标记在火炬松基因组中检测到的位点杂合度相近(Remington et al., 1999)。

图 2 CHS基因PCR产物的SSCP分析 Fig. 2 SSCP analysis of the PCR products of CHS 1~19为图 1中对应样品的PCR产物；A，B，C和D为该基因的2个等位基因对应的4条DNA单链。A和B为等位基因1的2条单链，C和D为等位基因2的2条单链。CHS在检测个体的二倍体组织中是杂合的，因而在单倍体胚乳组织中发生分离。 1~19 are the PCR products as indicated in fig. 1.A, B, C and D are the bands corresponding to each single strand of the two alleles of this gene.A and B are the single strand of allele 1, C and D are the single strand of allele 2.The CHS gene is heterozygous in the diploid tissue of the tested tree, thus segregates in its haploid megagametophytes.

在马尾松中测试了数量有限的在其他松树中开发的EST引物，尽管本研究的数据不足以提供一个可靠的统计参数，但是本研究结果显示：在松属不同树种间能够通用且在单株树中为杂合的EST位点比例是比较低的。对于通用的引物是否可以定位，主要取决于它在作图个体中是否杂合。由于只有杂合的位点才能用于作图，因此可以利用多家系构建共祖先图谱的策略进行转录图谱的构建，因为在某一个体中纯合的基因位点，在另一个体中可能为杂合。这样随着作图家系的增多，能够检测到分离的杂合位点比例也会相应增加，种内不同个体间基因在染色体上的排列具有高度的同线性顺序，因此可以利用这些基因产生的标记构建出某一树种的共祖先图谱，将这一物种作为一个大遗传系统进行研究(Yin et al., 2004)。

利用编码核DNA的序列开发PCR标记为转录图谱的构建提供了一个可行的方法(Plomion et al., 1999)。如果引物的序列是根据功能已知的基因设计而来，那么很快就会完成松属转录图谱的构建。在本文提到的突变检测技术中，SSCP技术操作简单，成本低廉且检测突变的灵敏度高。本研究建立了在松属中进行SSCP分析的实验室手工操作的优化程序，同时为正在进行的马尾松转录图谱的构建提供了一个初步的研究结果。根据本研究获得的信息，采用多家系作图策略进行EST转录图谱构建比常用的单家系作图策略更为有效。