采后高CO₂冲击处理可抑制果实呼吸作用、减少腐烂发生、降低乙烯产量和果实软化速率，从而提高耐藏性、延缓衰老，这已在许多果蔬上得到证实(Kubo et al., 1989；Colelli et al., 1991；1993；Meri et al., 1995；周宏伟等，1993)。研究表明¹⁾，在板栗萌动前后用高CO₂处理对抑制萌芽、降低淀粉酶活性、延缓淀粉水解都有一定效果，但CO₂含量过高、处理时间过长，会导致板栗变苦，用10%~40%的CO₂对已进入萌芽期的板栗进行处理容易造成生理伤害。高CO₂含量会刺激果实内乙醇、乙醛和其它挥发性物质的积累，进而增加丙酮酸脱氢酶和乙醇脱氢酶活性，影响果实风味(Ke et al., 1991；Norman et al., 1971；Wang et al., 1989；Mapson et al., 1970；田世平, 2000)。乙醇等有害物质的过量积累导致坚果中毒，扰乱正常生理代谢，致使抵抗病菌侵染和不良环境的能力下降，引起坚果腐烂，板栗贮藏期间腐烂与呼吸代谢途径变化密切相关(王晓明等，2001)。板栗比较耐低O₂和高CO₂，因而气调贮藏效果较好(王贵禧等，2000)。目前我国板栗采后主要采用冷藏，为了提高冷藏效果，以“大红袍”板栗(Castanea mollissima Blume, cv.dahongpao)为试材，研究0 ℃下板栗对高含量CO₂冲击处理的耐受力及其反应机制，并探讨CO₂处理后对提高板栗冷藏品质和耐藏性的可行性。

1) 李全宏.板栗采后生理、贮藏技术和运输条件的研究.北京农业大学硕士学位论文，1992

1 材料与方法 1.1 试验材料

大红袍板栗选自安徽省舒城县，于1998—2001每年10月初运至北京，即入0 ℃冷库预冷，挑选备用。

1.2 试验方法

试验设6个处理，用配气装置配制O₂含量为3%，CO₂含量分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%的气体(其余为氮气)，空气处理为对照。每处理用果量9 kg，3次重复，置于20 L广口瓶中。广口瓶密闭后，分别由进气口通入已配制好的不同含量O₂/CO₂气体，出气口与大气相通。各组在不同O₂/CO₂含量下分别处理10、20、25 d后取样，每次取样3 kg装入0.03 mm厚打孔聚乙烯塑料袋0 ℃冷藏。定期取样调查并测定理化指标。气体成分用奥氏气体分析仪测定。

1.3 测定指标及方法 1.3.1 乙醇含量测定

取15 g板栗样品研磨后用100 mL蒸馏水洗入三角瓶中蒸馏，收集蒸馏液于50 mL容量瓶中至刻度。另取三角瓶，加入0.1 mol·L^-1重铬酸钾溶液20 mL，5 mL浓硫酸，10 mL蒸馏液。加热回流，使溶液微沸10 min。待回流液冷却后，加入1 g KI，密闭于暗处5 min。用0.1 mol·L^-1Na₂S₂O₃溶液滴定上述溶液，颜色由橙色变为黄色时加入5 mL 0.5%淀粉指示剂，继续滴定至溶液由兰色变为绿色为止。

1.3.2 乙醇脱氢酶(ADH)活性测定

取1.0 g板栗样品，按4倍体积加入预冷的酶提取液[0.2 mol·L^-1Tris-HCl，pH＝8.0(含2 mol·L^-1 KCl，0.02 mol·L^-1EDTA)]，于冰浴中研磨成匀浆，10 000×g 4 ℃离心20 min，取上清液即为粗酶提液。酶反应总体积为3 mL，含2.7 mL 0.1 mol·L^-1 pH=9.0的Gly-NaOH缓冲液，0.1 mL 5 mg·mL^-1 NAD⁺，0.1 mL 1.7 mol·L^-1乙醇，于25 ℃温浴10 min。加粗酶提液0.1 mL启动反应，于340 nm处做时间扫描，以每分钟O.D值增加0.01为一个酶活单位(u)，酶活性用u·mg^-1蛋白min^-1表示。同时吸取粗酶提液0.1 mL，放入具塞刻度试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G250试剂，充分混合，放置2 min后，在595 nm波长下比色，记录O.D值。通过牛血清白蛋白标准曲线查得酶含量值(mg·mL^-1)C。以蒸馏水作空白(刘祖祺，1994；中国科学院上海植物生理研究所，1999)。

1.3.3 淀粉含量和可溶性糖含量的测定

(1) 淀粉样品液制备：取15.0 g样品，研磨后用约70 mL 1% HCl洗入100 mL容量瓶中，沸水浴3 h，使淀粉完全水解。取出冷却后用30% NaOH中和至溶液成微酸性(pH＝6.0)，过滤，得到淀粉水解液。(2)可溶性糖样品液制备：取5.0 g样品，研磨后用70~80 mL蒸馏水洗入100 mL容量瓶中，加入5 mL 1 mol·L^-1NaOH，混匀后加入6 mL 10%硫酸锌，用水定容到100 mL，混匀，过滤。取25 mL滤液转入50 mL容量瓶中，加入1 mL浓盐酸，沸水浴10 min。冷却后用1 mol·L^-1的NaOH中和至淡粉色，用水定溶到50 mL。(3)淀粉和可溶性糖含量测定：均采用3, 5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定。于试管中加入1.0 mL样品液、1.0 mL蒸馏水、1.5 mL 3, 5-二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5 min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向各管中加入21.5 mL蒸馏水，摇匀, 于520 nm处测O.D值。通过葡萄糖标准曲线上查得相应含量(中国科学院上海植物生理研究所，1999)。

1.3.4 异味指数

式中:A为异味指数；G_i为异味级别；N_i为该级别果数；G为异味最高级别；N为调查总果数。

异味级别分0级：无异味；1级：稍有异味，极淡；2级：有异味，可食；3级：有明显异味和强烈刺激性味道，不可食。

1.3.5 腐烂率

将板栗剖开，调查发病情况，每次每处理调查50粒。

1.4 数据处理

差异显著性分析采用SPSS软件，进行邓肯氏新复极差测验。

2 结果与分析 2.1 采后高CO₂冲击处理对板栗风味的影响

板栗异味指数的高低直接反应了板栗异味程度的大小。气体含量和处理时间是2个决定性的因素，总体来说，处理时间越长、CO₂含量越高，对板栗的伤害越严重(表 1)。同时研究还发现，处理时间与CO₂含量共同影响板栗解除处理后风味的恢复能力。从表中可见，高CO₂处理10 d的各处理板栗样品在处理结束时均没有产生异味，且在处理后的整个冷藏过程中风味正常。高CO₂处理超过20 d时可以使板栗产生不同程度异味。在脱离高CO₂逆境后的贮藏过程中，随着贮藏时间的延长，异味指数逐渐降低，说明异味程度逐渐减轻；不同处理组板栗的异味消除速率不同，CO₂含量小于40%时，板栗在冷藏60 d时异味即完全消除，而CO₂含量大于50%的处理组板栗直到冷藏结束时仍存在不同程度异味。说明这样的处理对板栗产生了严重的不可逆伤害。

2.2 采后高CO₂冲击处理对板栗乙醇含量和ADH活性的影响

CO₂含量对乙醇含量和ADH(乙醇脱氢酶)活性有显著影响(图 1)。在高CO₂处理结束时，各处理组板栗的乙醇含量和ADH活性均达到最高值，乙醇含量和ADH活性变化与CO₂含量和处理时间显著正相关。在处理后的贮藏过程中，随着冷藏时间的延长，乙醇含量和ADH活性逐渐降低，到冷藏120 d时，CO₂含量相对低的处理组板栗的乙醇含量和ADH活性基本恢复到正常水平，各处理之间没有显著差异，且与对照相当。

2.3 采后高CO₂冲击处理对板栗淀粉含量的影响

淀粉是板栗的主要贮藏物质之一，采后高CO₂处理直接影响淀粉在贮藏期间的降解。图 2可见，各处理组板栗淀粉含量在整个贮藏过程中呈逐渐下降的趋势，但各处理组板栗淀粉在各个不同阶段的水解速率不尽相同。在处理结束时，各处理组之间淀粉含量差异相对较小，但在处理后冷藏的过程中各处理之间逐渐表现出一定差异，至冷藏120 d时，各处理间差异已明显表现出来。CO₂含量为30%和40%的各处理组板栗淀粉含量普遍高于其他处理及对照，其中采后冲击处理20 d、CO₂含量为40%的处理组板栗淀粉含量最高，为36.02%。过高的CO₂含量处理促进淀粉的降解，采后冲击处理20 d、CO₂含量为80%的处理组板栗淀粉含量最低，仅为31.52%。

2.4 采后高CO₂冲击处理对板栗可溶性糖含量的影响

板栗的甜味主要取决于可溶性糖含量，因此板栗中可溶性糖的多少直接影响板栗的风味。图 3可见，在冷藏120 d时，采后高CO₂冲击处理20 d的各处理组板栗可溶性糖含量均高于采后冲击处理10 d和25 d的相应处理的值，采后冲击处理25 d的各处理的可溶性糖含量最低。由此可见，适宜的CO₂含量和处理时间相配合可以使板栗在贮藏末期保持一定的糖含量，进而提高板栗风味。

2.5 采后高CO₂冲击处理对板栗腐烂率的影响

采后高CO₂冲击处理在影响板栗品质变化的同时，还影响板栗的耐藏性(图 4)。适宜的高CO₂处理可有效控制板栗贮藏期腐烂的发生，提高板栗耐藏性，其中40%CO₂处理20 d的板栗腐烂率最低，仅为1.0%。若高CO₂处理不当则会对板栗造成伤害并降低板栗的抗病性和耐藏性。因此，从营养物质含量、腐烂率和风味等指标综合比较看，以40%CO₂处理20 d的板栗贮藏效果最好。

3 讨论

随着果蔬采后生理、病理等方面研究的深入，果蔬采后短时高CO₂冲击处理的研究越来越受到人们的关注，并逐渐成为一种提高品质和耐藏性的采后处理措施。适宜的高CO₂处理可明显降低果蔬的呼吸强度、乙烯释放和腐烂的发生，并可较好地保持其鲜亮的外观色泽和良好品质，有效延长贮藏保鲜期。不同果实对CO₂的耐受力不同，如当CO₂含量达到1%以上时，即可引起Anjou、Bartlett和Bosc梨果肉褐变(Blanpied et al., 1973)；10%~40% CO₂对冷藏板栗的萌芽有明显的抑制作用，但CO₂含量过高、处理时间过长，会导致板栗变苦(李全宏，1993；1995)。本研究表明，高CO₂处理使ADH活性显著增加，乙醇含量明显升高。30%~80%高CO₂冲击处理超过20 d会使板栗产生不同程度异味，但CO₂含量低于40%处理可以使板栗在解除逆境后的贮藏过程中异味逐渐消除并恢复正常风味，而当CO₂含量高于50%时，风味则发生不可逆变化。研究结果表明，30%~40%CO₂冲击处理20 d可以降低淀粉水解速率，有效保持淀粉含量，降低腐烂率，并保持较好风味，有利于板栗保持良好的贮藏品质。

先期的研究发现，板栗对低氧有较强的适应性，在O₂含量为3%时不会对板栗产生伤害(王贵禧等，2004)。本研究进一步发现，在3%O₂条件下，高CO₂处理使板栗产生异味，CO₂处理强度(含量和时间)决定异味程度大小。这主要是由于板栗在此条件下有氧呼吸受阻，在无O₂或缺O₂条件下生成乙醇、乙醛等发酵产物(王晓明等，2001)。若在此条件下处理时间越长，则这些物质在细胞内的积累越多，含量太高的发酵产物将导致异味加重。由于这些发酵产物具有一定的挥发性，当其含量不太高、在细胞内积累的时间不太长时，所产生的异味较轻，将其在正常气体条件下放置一段时间，异味会自行消除，风味仍可恢复正常。果实组织也可以代谢乙醇，低氧处理的‘Delicious’苹果在移入正常大气环境中7 d，乙醇含量下降了50%(李文忠等，1992)。若发酵产物含量过高、积累时间越长，则可导致细胞伤害。在这种情况下，即使将板栗放置于正常气体条件下，其异味也很难消除，即使异味消除了，其风味口感也欠佳。在解除高CO₂逆境后的贮藏过程中，有些板栗的异味可以逐渐减轻直至恢复正常风味，而有些则不能恢复到正常水平，说明这样的处理已经对板栗造成了不可逆伤害。

关于高CO₂可以有效降低腐烂发生，已在一些果蔬的研究中得到证实(Colelli et al., 1991; 1993; 姜爱丽等，2002)。本研究发现，适宜的CO₂含量和处理时间可有效降低板栗腐烂率。CO₂含量过高、处理时间过长，可能会对板栗本身造成生理伤害，乙醇含量过高是导致生理病害的主要因子(王晓明等，2001)。板栗在贮藏期间的腐烂主要是由于病原菌的潜伏侵染造成的(梁丽松等，2003)，适当的高CO₂处理除对病原菌有一定的直接抑制作用外(梁丽松等，2004)，板栗因发酵产生适量的乙醇对潜伏在板栗内部的病原菌可能有抑制作用(作者在枣的研究中也发现同样现象)，但如果积累的乙醇浓度过高，在解除处理后的冷藏过程中，板栗因中毒而降低了抗病性，会进一步遭受微生物的侵染而腐烂，这可能就是本研究发现高CO₂处理20 d的板栗发病率比处理10 d或25 d低的原因。