二次回归正交试验设计是一种广泛用以处理多因素试验的科学方法，它将回归分析法与正交试验法有机结合起来，采用组合设计，具有试验次数少，数据处理简便，并可进行优化分析等优点。二次回归正交试验设计在一些农林的小区试验中已有不少成功的例子，但在植物组织培养中的应用少见报道。

微型月季(Rosa cv.Sonnen Kind)株高一般不超过30 cm；茎细，节间短，叶小、互生、奇数羽状复叶；花单生，花朵较小，常为重瓣，花朵密集，花色丰富；植株小巧玲珑，适合作居室、餐桌等台面的装饰美化。近年来，关于微型月季组织培养的研究不时有报道(Salehi et al., 1997; 李艳等，2001；洪立萍等，1995)，其研究重点是培养基的选择、激素浓度和比例等的确定，这些参数是微型月季组织培养工厂化的重要依据。因此，有必要采用较严谨高效的手段克服其盲目性和偶然性而进行优化处理，从而实现种苗的高效繁育。本文以微型月季茎段不定芽分化培养基中细胞分裂素6-BA和生长素NAA浓度的优选为例，建立其组织培养中二次回归正交设计的应用方法，实现该激素浓度和比例的定量优化。

1 材料与方法 1.1 取材及培养条件

供试材料微型月季取自本实验室培养的组培苗，为降低实验材料的激素背景干扰，在不添加任何植物激素的MS培养基(空白培养基)上培养40 d，剪取带一个腋芽的茎段，长约1.5 cm左右，接种在以二次回归正交设计的含有不同浓度6- B A(0~3 mg·L^-1)、NAA(0~1 mg·L^-1)组合的各种MS培养基上。每处理接种10个带腋芽的茎段，培养40 d，按每处理茎段分化的总芽数进行二次回归正交分析。接种的材料在人工培养室内培养，温度26~28℃，每天光照10~12 h，光照强度1 600 lx，相对湿度70%。

1.2 二次回归正交试验设计

(1) 二次多项式回归方程的确立  二次回归正交实验设计要求每个因素都取5个水平进行组合设计，建立二次多项式回归方程：,式中，i、j分别代表不同因素(如细胞分裂素、生长素等)。本试验仅涉及细胞分裂素6-BA和生长素NAA 2个因素，因此建立二元二次回归方程：,式中，b₀为常数项，b₁、b₂为一次项回归系数，b₁₂为交互项回归系数，b₁₁、b₂₂分别为因素1和因素2的二次方效应回归系数。

(2) 试验各因素5个水平及其编码值的确定  为叙述方便，将因素j的水平定义为Z_j，如6-BA和生长素NAA 2个因素均分别取5个水平，参考微型月季组织培养文献中使用的浓度分别确定其最高浓度和最低浓度(即水平的上限和下限)。因素的最高浓度即高水平(上限)记作Z_2j，编码值为γ，有关γ值的确定参考续九如等(1995)；因素的最低浓度即低水平(下限)记为Z_1j，编码值为－γ；因素的平均水平记为Z_0j，编码值为0。Z_0j为上限和下限水平的算术平均值：Z_0j=(Z_2j+Z_1j)/2。在试验设计中，Z_0j叫零水平或中间水平(下同)。至此已经确定了因素j的3个水平(即3个浓度)：Z_1j, Z_2j, Z_0j。其他2个水平分别记作l和－l，其数值根据Z_j的变化范围来计算。Z_2j到Z_0j的单位编码值连续变化区间记作 Δ_j，其算式为：Δ_j=(Z_2j-Z_0j)/γ。l水平为Z_0j+Δ_j，编码值为1；－l水平为Z_0j－Δ_j，编码值为-1。

回归设计重复的设置方法有2种：①整个试验重复2~3次；②仅在零水平的试验组合设置重复，其重复次数m可自定。根据m值和因素数可以从续九如等(1995)查得γ的具体数值。

(3) 试验水平的计算  6-BA和NAA 2个因素，根据经验其在组织培养中诱导不定芽的最高使用浓度分别为3.00，1.00 mg·L^-1，最低浓度均为0 mg·L^-1，零水平的实际用量分别为1.50，0.50 mg·L^-1。零水平重复6次，从文献查得γ值为1.32，则该2个因素的浓度变化区间Δ_j分别为1.14和0.38，根据Δ_j计算出2因素的l水平和－l水平的实际用量。6-BA与NAA二次回归正交设计的编码值与浓度见表 1。

(4) 试验方案  选用L₄(2³)正交表(续九如等，1995)，把各因素(6-BA和NAA)编码值分别安排在所选正交表的有关列上，正交表的表头设计就是试验方案，表内的试验号即为处理组合号。另外在正交表的最前面添上一个x₀列，编码值全为“1”，用来估算回归方程中的常数项b₀。在原正交表的各因素x₁、x₂列下面均添加γ与－γ行。交互列x₁x₂的编码值可用有关列的编码值相乘得到。二次项列x₁²和x₂²的编码值需进行中心化处理，转变成离均差，以中心化编码值x_j^′代替平方项编码值：,因此避免了直接平方后使组合设计的正交性受到破坏。由此得到的正交设计表如表 2所示。

(5) 试验数据采集  表 2中x₁、x₂的编码值分别是6-BA和NAA各水平的编码值，按表 1中6-BA和NAA各水平的实际用量进行不同浓度的组合配比试验，其中试验组合9~14为6-BA和NAA零水平时的浓度组合，即6次重复。1~14号为14种组合的MS基本培养基，微型月季茎段在这些培养基中培养40 d时，统计茎段增殖的总芽数列于表 2的最后一列。

2 数据的统计分析 2.1 统计分析

根据采集的试验数据计算各项回归系数，以这些回归系数建立的二元多项式回归方程为：ŷ=65.658+14.135x₁-5.007x₂-0.75x₁x₂-19.309x₁²-6.105x₂²，检验结果(表 3)表明，回归方程极显著。各项回归系数的检验结果(表 4)表明, 一次项系数b₁、b₂和二次项系数b₁₁、b₂₂极显著, 交互项系数b₁₂不显著。因此，在建立回归方程时，交互项可以剔除，但为了相互比较和建立方程，本试验仍予以保留。

考虑到回归方程显著，并不一定表示二次回归方程拟合良好，还需要进行回归模型的拟合测验(表 5)。本试验为在零水平处重复6次，纯误差平方和与失拟平方和的差异性检验结果(F＜F_0.05), 表明回归方程拟合良好。将自变量编码值x_j转换为原自变量Z_j，得到以Z_j为自变量的回归方程为：ŷ＝8.349+57.839Z₁+31.6985Z₂－1.731Z₁Z₂－14.858Z₁²－42.278Z₂²。依据函数求极值的方法得到处理组合的最大增殖数为69。该处理中6-BA为1.93 mg·L^-1，NAA 0.33 mg·L^-1。

2.2 模拟寻优

本试验为2因素5水平，共有5²＝25个处理组合(图 1)，其中不定芽增殖数>50的处理组合有9个，其各因素水平频率见表 6。

3 结果与讨论

将表 6中x₁与x₂的置信区间代入Z_j=Z_0j+Δ_jx_j，可以算出x₁(6-BA)和x₂(NAA)在95%置信区间的实际用量分别为1.68~2.75 mg·L^-1和0.07~0.54 mg·L^-1，即当培养基中6-BA和NAA的浓度分别控制在该范围内时，接种10个芽，培养40 d，可增殖50个以上的不定芽，其可靠性为95%。为验证该浓度的可靠性，在MS基本培养基中分别添加6-BA 1.8 mg·L和NAA 0.3 mg·L^-1，该浓度为置信范围内随机抽取的浓度组合。接种带一个腋芽的微型月季茎段40个，培养40 d不定芽增殖数为278个，平均每接种10个腋芽增殖到69.5个不定芽(>50个)，增殖范围在上述置信区间内，该试验方法是正确的，结果是可靠的。

回归正交设计是根据数理统计学观点，以正交性原理，对多个因素同时进行考查，在各个因素都处于变动的情况下，用一套规范化的正交表来合理地安排试验。它以较少的试验获得精度较高的回归方程。植物组织培养中的正交试验设计方法也有报道，而本文的特点在于以二次回归设计方程更精确地筛选微型月季组织培养中所用的各植物激素的浓度配比，既保留了正交试验设计的优点，又达到浓度优化的目的。

一般认为植物器官分化的倾向是取决于内源激素的平衡，外源激素通过改变内源激素的平衡而产生作用。为了使内源生长素和细胞分裂素达到平衡，外加的细胞分裂素及生长素要求达到一定的浓度和比例，才能使器官发生达到预期目的。切花月季萨曼沙产生芽的试验(何松林等，1996)表明，诱导芽的培养基以MS+BA 2 mg·L^-1和MS+BA 2 mg·L^-1 +IBA 0.1 mg·L^-1较好。6-BA可有效地诱导芽的萌发与增殖，低浓度的生长素可以促进茎的伸长。本试验中，微型月季不定芽以离体茎段增殖培养，对细胞分裂素和生长素浓度的要求有一定的范围，分别为1.68~2.75 mg·L^-1和0.07~0.54 m g·L^-1，而在该范围内，二者的浓度达到最适合微型月季分化时将有更多的芽形成(见表 2，第8~14号培养基)。

除了植物激素，其它因素也影响不定芽的分化，如材料来源、温度、湿度、光照、pH值等，为了消除或尽可能减少不明因素的干扰，本试验尽可能地做到取材一致，温度、湿度、光照和pH值等培养条件以及培养基基本一致。通过二次回归分析表明：微型月季茎段不定芽分化培养基中激素浓度的最佳组合是6-BA 1.93 mg·L^-1、NAA 0.33 mg·L ^-1，在该培养基上接种10个芽培养40 d可增殖69个；而在6-BA和NAA的浓度分别为1.68~2.75 mg·L^-1和0.07~0.54 mg·L^-1的MS培养基上，可增殖不定芽50个以上。这也进一步说明二次回归正交设计能更精确地筛选和模拟寻优组织培养中的各种植物激素浓度和配比。