松属是绿化荒山和营造经济林的重要树种，生命周期较长，采用常规的有性繁殖方法进行改良往往要花费很长的时间，而应用无性繁殖方法则能加速树种改良和提高生产能力。组织培养是快速繁殖苗木，特别是繁殖优良树种的捷径，同时也是进行遗传操作、改良树种的前提(龚峥，1990；王明庥，2001；黄健秋等，1994)。针叶树种的组织培养研究开始较晚。Ball(1950)从北美红杉(Sequoia sempervirens)愈伤组织分化得到芽，从此，针叶树种的试管繁殖逐渐受到重视，松属获得试管苗始于Sommer等(1975)对长叶松(Pinus palustris)的研究, 至今已对松属50多个种或变种的胚、子叶、下胚轴、针叶和悬浮细胞等进行了培养，获得试管苗的树种已有31种。我国仅对欧洲赤松(Pinus sylvestris)、火炬松(P.taeda)、白皮松(P.bungeana)、樟子松(P.sylvestris var. mongolica)、马尾松(P.massoniana)、油松(P.tabulaeformis)和华山松(P.armandi)等进行了离体培养，仅有欧洲赤松、马尾松和火炬松诱导生根产生了试管苗(黄健秋等，1994；邢世岩，1990；康明等，1993；成小飞等，1995；郑均宝等，1994；吴若菁，1993；齐力旺等，1996；韩素英等，1995；崔溦等，1985；初立业等，1995；阙国宁等，1997)。美国黄松(Pinus ponderosa)是20世纪70年代以来我国引进的树种中表现较好的一种，其成熟时树皮很厚，含有11%的橡胶物质，绝热性好、抗火力强(Fonda et al.，1998；张景群等，1999；Richard，2001)，是良好的防火树种。但由于结实间期长，种子产量低，种子远远不能满足实际需要，必须从美国购种。因此，进行美国黄松离体培养和快速繁殖研究在理论上和实践上均具有重要意义。但美国黄松离体培养国外研究较少(Tuskan et al., 1990；Lin et al., 1991)，国内还未见报道。近几年来，我们以美国黄松成熟胚为材料，在离体条件下由胚诱导产生了不定芽，又诱导不定芽生根产生了试管苗，初步筛选出较好的培养基，其结果将为美国黄松苗木快速繁殖提供重要的基础资料。

1 材料和方法 1.1 供试材料

供试材料为从美国购进的成熟的美国黄松种子。

1.2 方法 1.2.1 不定芽诱导

选择成熟、饱满、均匀一致的美国黄松种子，经浸泡充分吸胀后剥去种皮，用750 g·kg ^-1乙醇浸泡20 s，1 g·kg^-1 HgCl₂消毒10 min, 无菌水冲洗4次，于无菌条件下用小解剖刀剥去胚乳，取出成熟胚接种到不定芽诱导培养基中，接种成熟胚置于(25±1) ℃、1 500 lx光照条件下培养，每天光照14 h。不定芽诱导选用GD、SH、MS和N₆ (陈正华，1986；李曙轩等，1983；杨增海，1987)4种基本培养基附加20 g· kg^-1蔗糖、0.6 g·kg^-1琼脂，pH5.8，不同浓度的6-苄基氨基嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)。按L₁₆(4⁵)正交试验设计，共16个处理。不定芽诱导率=(产生不定芽的胚数/接种胚的总数)×100%。

1.2.2 不定芽的生长和增殖

不定芽生长采用GD和SH基本培养基附加10 g·kg^-1蔗糖、6 g·kg^-1琼脂和1 g·kg^-1的活性炭，pH5.8，不加任何激素，每30 d继代1次。不定芽增殖以1/2 GD，1/2 SH(大量元素减半)为基本培养基，附加0.5 mg·L^-1 6-BA、10 g·kg ^-1蔗糖、6 g·kg^-1琼脂和1 g·kg^-1活性炭，pH5.8。不定芽增殖率=不定芽的总数/接种不定芽数。

1.2.3 不定根的诱导

将长5 mm的不定芽分别接种到GD、SH、1/2 SH基本培养基，附加1 g·kg^-1蔗糖、6 g·kg^-1琼脂，pH5.8，不同浓度的NAA和吲哚乙酸(IAA)，按表 1设计试验，接种后置于(25±1)℃、1 500 lx光照条件下培养，每天光照14 h。不定根诱导率= (产生不定根的不定芽数/接种不定芽的总数)×100%

2 结果与分析 2.1 黄松成熟胚的脱分化与不定芽的形成

接种3 d后，在GD和SH培养基上的胚子叶张开，7 d后叶子开始变绿，10 d后子叶开始变形，增粗、缩短直接形成芽体，这种芽体继代培养后分化丛生芽(图 1)。同时，部分成熟胚培养7 d后子叶变绿，并逐渐脱分化形成愈伤组织，愈伤组织在原培养基上生长分化出不定芽点，芽点再逐渐长成芽丛(图 2)。在所试验的各种组合中，下胚轴只观察到可产生愈伤组织，而无任何器官发生。

2.2 培养基种类和6-BA、NAA对外植体不定芽诱导的影响

从消毒后的种子剥出种胚，接入按L₁₆(4⁵)正交设计的不定芽培养基中，培养40 d后，统计分析不同处理外植体不定芽的诱导和增殖率(表 1)。表 1表明，不同处理间外植体不定芽诱导率差异较大，对外植体不定芽诱导影响最大的是培养基的种类，植物激素次之；GD培养基诱导不定芽最好，SH次之，MS和N₆最差。GD+6-BA 0.5~1.0 mg·L^-1 +NAA 0.5~1.0 mg·L^-1诱导率最好，达50%以上，平均增殖率6~7，最大增殖率为10；SH+6-BA 2.0~4.0 mg·L^-1+NAA 0.5~1.0 mg·L^-1诱导率较高，大于30%，平均增殖率6~7，最大增殖率为11；不定芽诱导培养基的最佳组合GD+6-BA 0.5 mg·L^-1，其诱导率为55%，平均增殖率为6。

对L₁₆(4⁵)正交试验进行单因子效益分析，结果表明，在供试的4种基本培养基中，GD培养基对不定芽的诱导率最高；6-BA浓度为0.5~1.0 mg·L^-1时，不定芽的诱导率最高，NAA在供试范围内均表现出负效应。

2.3 不定芽的生长和增殖

将子叶和愈伤组织分化产生的不定芽接入GD和SH，30 d继代1次，发现它们都能使不定芽进一步伸长。将子叶和愈伤组织分化产生的不定芽接入1/2GD和1/2SH，培养30 d后，统计分析不同处理不定芽的增殖率(表 2)。将伸长的不定芽进一步继代培养即可成为无根试管苗(图 3)。表 2表明，2种培养基上不定芽的增殖差异不大，1/2SH上不定芽的增殖率较大，1/2GD上不定芽的增殖率较小，分别为6.88和5.38。

2.4 培养基种类和NAA、IAA对不定芽生根诱导的影响

把不定芽接入按表 3设计的不定根诱导培养基中，在培养30 d后，统计分析不同处理不定芽的生根诱导率(表 3)。表 3表明，不同处理间不定芽诱导率差异较大，基本培养基的使用浓度对不定芽诱导生根影响很大。GD、SH培养基不能诱导不定芽生根，1/2 SH培养基可以诱导不定芽生根，其对不定芽的诱导率为2.2%，NAA对不定芽生根具有促进作用，1/2 SH+ NAA 0.5 mg·L^-1对不定芽生根的诱导率为3.3%(图 4)。

3 结论与讨论

针叶树种中, 松树的培养最困难(王明庥，2001)。目前国内组织培养(松科)用的最多的培养材料有幼胚、成熟胚、子叶、胚珠、下胚轴切段，以及无菌苗和实生苗外植体(龚峥，1990)。利用松树成熟或未成熟胚以及萌动芽上幼嫩子叶、下胚轴等胚性外植体可以取得最佳诱导效果(黄健秋等，1994)。胚及芽萌动的幼苗是松树微体快繁最常用的外植体(邢世岩，1990)。木本植物组织培养的困难之一是建立无菌材料(陈正华，1986)，在建立无菌培养物时，外植体表面灭菌关系到试验成败(黄健秋等，1994；王明庥，2001)。本试验将经浸泡充分吸胀后剥去种皮的美国黄松种子，用750 g·kg^-1乙醇浸泡20 s，再用1 g·kg^-1 HgCl₂消毒10 min，无菌水冲洗4次，于无菌条件下用小解剖刀剥去胚乳，取出成熟胚接种到不定芽诱导培养基上，极少染菌。

目前，松属器官分化中，最常用的基本培养基有GD、SH、DCR、LP和LM等，此外还有MS及各改良MS培养基、CD、WPM、MCM以及Rancillac培养基。高盐浓度的MS培养基不利于松属器官分化(黄健秋等，1994；邢世岩，1990；龚峥，1990)，本研究结果与之相符。基本培养基是美国黄松成熟胚离体培养形成不定芽的关键，GD最好，SH次之，MS和N₆则不适用。这与成小飞等(1995)对马尾松的研究结论相似。基本培养基浓度对美国黄松不定芽生根至为重要，GD、SH培养基不能诱导其不定芽生根，1/2 SH可以诱导不定芽生根。

植物激素的种类、浓度、配比和处理方式对松属器官的分化都会产生很大的影响。一般说来，诱导丛生芽时，外植体必须培养在细胞分裂素/生长素较高的培养基上，BA和NAA组合效果较好。但在许多针叶树培养中，单独使用细胞分裂素，足以诱导芽发生(成小飞等，1995；Aiteken et al., 1981)。当外植体或愈伤组织诱导出芽之后，为使芽进一步生长发育，常需将芽转移到无激素或低浓度激素的培养基上(黄学林等，1995；黄健秋等，1994；奚元龄等，1990；邢世岩，1990；颜昌敬，1990)。本试验单独使用细胞分裂素6-BA诱导美国黄松成熟胚形成不定芽。6-BA能促进美国黄松成熟胚和愈伤组织不定芽的形成，但对芽的生长有一定的抑制作用。NAA不利于美国黄松成熟胚不定芽的诱导，但对不定芽生根具有促进作用。

在很多木本植物的组织培养中，常是先诱导产生苗，然后在新的培养基诱导生根。所以，苗与根的发生是分两步进行的。在松属的组织培养中也有类似情况，一般是芽产生后，要重新更换培养基才产生根(崔溦等，1985)。诱导芽生根的方法有降低培养基中盐类含量，减少糖含量，降低培养温度暗光处理，施用生长素等(颜昌敬，1990)。尽管大多数松属树种的芽繁殖可以通过胚性外植体来完成，但由此产生的小芽即使在有生长素存在时也很难生根(黄健秋等，1994)。本试验降低大量元素的高盐浓度(SH→1/2 SH)和蔗糖浓度(2%→1%)诱导不定芽生根，在离体培养条件下，以美国黄松成熟胚为外植体获得了再生小植株。

美国黄松成熟胚离体培养不定芽形成有2种途径：子叶直接形成不定芽(奚元龄等，1990)；子叶经愈伤组织再分化不定芽。这与油松成熟胚离体培养不定芽的形成有相似之处(郑均宝等，1994)。GD+6-BA 0.5~1.0 mg·L^-1+NAA 0~0.1 mg·L^-1对美国黄松成熟胚的诱导率最高；SH+6-BA 2.0~4.0 mg·L^-1+NAA 0.5~1.0 mg·L^-1的诱导率较高；GD+6-BA 0.5 mg·L^-1是美国黄松成熟胚离体培养形成不定芽的较佳组合。GD、SH对不定芽生长具有促进作用；SH+IAA 1.0mg·L^-1对不定芽生长具有较好的促进作用；1/2 SH、1/2 SH+NAA 0.5 mg ·L^-1对不定芽生长具有很好的促进作用，对不定芽生根的诱导率分别为2.2%、3.3 %。

植物不定根的形成是一系列分化发育事件顺序性累积的结果，首先是某一特定的组织细胞块脱分化，进而进行有序的细胞分裂、分化出根原基，并进一步分化、生长，发育出可见根(黄学林等，1995；裴东等，2002)。Jackson等(1986)将根的发育过程分为4个阶段：诱导期、根原基发端期、根发育期和伸长期，每个阶段各有其生理生化特征及其相应的调控因素。因此在根形成的不同时期，应有区别地使用生长素，同时要考虑生长素的种类、时间和浓度的影响，以及其他物质诸如细胞分裂素、酚类和其他添加物等的相互作用。本试验所得的结论是初步的，生根率还有待于进一步提高。