生物多样性是地球上生命长期进化的结果，更是人类赖以生存的物质基础。然而由于人口膨胀和经济发展所带来的压力，生态系统受到严重的破坏，大量物种已经灭绝或处于濒危状态。物种的灭绝意味着遗传多样性不可挽回的损失，原因是：一方面当一个物种消失的时候，它所携带的遗传信息就不复存在了；另一方面，现存物种的居群数目逐渐减少，居群规模不断变小，大而连续的生境不断破碎化时，种内的遗传多样性会随之下降甚至急剧丧失(洪德元等，1995)。Falk等(1991)和Avise(1994)均认为当前大量物种的基因库正在萎缩或破碎成许多小的基因库。Lugo(1988)估计，到20世纪末，将有15%~20%的物种灭绝，而由于遗传侵蚀所导致遗传多样性损失的速度要高于物种灭绝的速度。Maxted等(1997)以1988年为起点，认为到20世纪末植物遗传多样性的25%~35%将会丧失。因此，对生物遗传多样性，特别是对濒危动植物进行研究以利于更好的保护就显得尤其重要。近几十年来，分子生物学技术和生物化学技术的不断发展，为遗传多样性的研究提供了许多新的方法。目前同工酶电泳、蛋白质序列分析、核酸序列分析、DNA指纹分析[如DNA限制性酶切长度多态性(RFLP)、随机扩增DNA多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)]等技术在该方面有着十分广泛的应用。其中，RAPD方法由于具有简便、快速、灵敏等优点，已经成为探索生物居群的遗传结构、研究生物遗传多样性和系统进化的重要手段。在植物方面的应用，主要集中在种质资源鉴定、遗传多样性分析、物种亲缘关系探讨以及物种起源和演化的研究等方面。

1 RAPD技术的原理和特点

RAPD技术是20世纪90年代初由美国杜邦公司农产品研究中心的J.G.K.Williams和美国加利福尼亚生物研究所的J.Welsh两个研究小组几乎同时建立的检测随机扩增多态DNA的分子生物学技术。它是以10 bp左右的随机寡核苷酸单引物，对基因组DNA进行扩增，扩增产物通过电泳分离后检测扩增产物的多态性。RAPD技术既继承了聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)效率高、特异性强、检测容易及样品用量少等特点，又具有独特的优势：模板DNA用量少、要求纯度低；不同物种可以使用通用的引物进行遗传分析；引物为随机设计的寡核苷酸引物，可以在对各种生物没有任何分子生物学研究的情况下，对其进行DNA多态性分析；技术简单，容易掌握且实验费用较低。

2 RAPD技术在珍稀濒危植物遗传多样性研究与保护方面的应用

遗传多样性，是指种内基因的变化，可以泛指地球上所有生物的遗传信息的总和，包括种内显著不同的居群间和同一居群内的遗传变异[世界资源研究所(WRI)等，1992；Bruno et al.，1996；葛颂，1997]。遗传多样性的本质是生物体在遗传物质上的变异(Rieger et al., 1991)，对其进行研究具有重要的理论和实践意义。首先，物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产物，是其生存(适应)和发展(进化)的前提。遗传变异是生物进化的内在源泉，因而，遗传多样性及其演变规律成为生物多样性及进化生物学研究的核心问题之一(施立明等，1993)。一个居群(或物种)遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，越容易扩展其分布范围和开拓新的环境(Huenneke，1991)。对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史(起源的时间、方式)，也能为进一步分析其进化潜力和未来命运提供重要资料(Soltis et al., 1991)，尤其有助于物种稀有或濒危原因及过程的探讨(Millar et al., 1991；陈灵芝，1993)。其次，遗传多样性是保护生物学研究的核心之一。遗传结构与物种繁衍或濒危灭绝密切相关，遗传多样性在一定程度上决定了物种的分布以及数量多样性。缺乏对生物遗传多样性的深入研究，就无法完整地认识物种的进化过程或适应机理，以及居群地理分布格局、数量增长及物种灭绝等问题(陈灵芝等，2001)。20世纪初，一些学者就指出稀有或特有种往往出现遗传上的衰退(遗传变异下降)。洪德元(1995)、Falk等(1991)的研究结果就证实了这种现象。Karron于1991年通过对11例同属物种间的对比研究，总结出特有或稀有种的遗传变异水平都要比其近缘(同属)广布种为低(转葛颂，1994)。显然，研究稀有(或特有)种尤其是濒危种的遗传多样性对于物种的保护极其重要。而RAPD技术已经广泛地应用于该研究领域，并卓有成效。

2.1 RAPD技术在种质资源研究方面的应用

遗传多样性的研究是种质资源研究的主要内容之一，不仅可以较为全面地了解现有种质资源的遗传多样性，以减少育种工作中亲本选配的盲目性，从而提高育种效率；而且可以有效地用于预测杂种优势和进行亲本选配。李周歧等(2002)用RAPD标记进行鹅掌楸(Liriodendron chinense)杂种识别和亲本选配，结果表明鹅掌楸基于RAPD标记的亲本遗传距离与子代1 a生苗高和地径生长量均表现为二次曲线相关，说明利用亲本遗传距离进行鹅掌楸亲本选配和杂种优势预测具有一定潜力。陈毓亨等(1999)应用RAPD技术，结合紫杉烷及紫杉醇含量测定和植物形态分类对南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)中紫杉烷高含量植株的分子特征、形态和生境的相互关系进行了探讨，指出3个地区(云南、江西和四川)可能存在紫杉烷高含量植株系，为资源利用和保护及优良品种的培育提供了基础。刘叔倩等(2001)对银杏(Ginkgo biloba)不同变异类型进行RAPD指纹研究，结果表明供试样品间遗传多样性水平低，遗传关系较近，提出在开发银杏种质资源时，首要任务是扩大银杏的自然变异率。

同时，RAPD技术还可应用于种质资源的鉴定，以鉴别形态学上很相似或亲缘关系非常相近的品种；或对植物性别进行早期鉴定及通过花粉标记以确定某植物的有效居群。Rieseberg等(1995)采用RAPD技术对蔷薇科濒危乔木Cercocarpus traskiae 11株成年个体和5株推测的杂种幼苗及常见同属种C. betuloides var. blancheae进行杂种鉴定，最后确定11个成年个体中有6个是C. traskiae纯种，5株是杂交起源。通过种质分析可为品种改良及种质交流奠定基础。王小梅等(2001)应用RAPD技术，筛选与银杏(Ginkgo biloba)性别相关的分子标记。应用150个10 bp随机引物及110对随机引物组合，检测了雌、雄银杏的基因组DNA，获得1个与雄性相关的RAPD标记，该标记的获得，为银杏性别的早期鉴定提供了可靠的理论依据，也为克隆性别相关基因奠定了基础。1987年在澳大利亚西部发现一濒危种Eucalyptus graniticola，其形态性状与野桉(E. rudis)非常相似，Rossetto等(1999)利用RAPD标记检测出E. graniticola为杂交种，并提出该植物种的保护应更注重迁地繁殖。黄双全等(1998)尝试用RAPD方法对鹅掌楸(Liriodendron chinense)花粉运动进行标记，得出其花粉散布距离可达100 m，显示出鹅掌楸的有效居群范围大，由此而认为RAPD可能成为一种广泛适应的花粉标记技术。Mayol等(2001)采用RAPD技术对2个濒危种(Borderea pyrenaica和B. chouardii)进行鉴别，这2个物种在形态学上非常的相近(只有一个B. chouardii居群被确认)，却生活在相异的环境中，使得许多学者认为B. chouardii仅是有着更广泛分布的B. pyrenaica的一个生态型。而Mayol等(2001)通过RAPD研究，认为：B. chouardii不是B. pyrenaica的生态型，分类系统应该承认这一特殊水平；B. chouardii不是B. pyrenaica近缘种。

2.2 RAPD技术在分析遗传多样性水平方面的应用

RAPD技术可以为同一物种居群间和居群内的遗传多样性水平提供比较详尽的分析，从而为进一步论证珍稀濒危物种存在的遗传衰退现象提供论据。Brauner等(1992)采用rDNA的RFLP和RAPD技术对智利Juan Fernandez群岛上的Lactoris fernandeziana的整个分布区内15个居群的27个个体进行了检测，发现在居群内和居群间均存在rDNA重复片段的长度变异和位点突变，用16个RAPD引物产生了106条扩增带，其中26条为多态的，11个引物在个体间扩增出差异条带，总的多态性为1.6%, 说明这一特有种的遗传多样性水平确实很低，因为该群岛另2个稀有属共9个种中均发现比较高的遗传多样性。

裸子植物松科的松属(Pinus)是典型风媒异花授粉的高大乔木，该属中大多数成员都有很高的遗传多样性，而且大部分变异存在于居群之内，居群间差异很小(Hamrick et al., 1992)。Mosseler等(1992)用RAPD技术对整个分布区脂松(Pinus resinosa)居群进行了检测，同时用了白云杉(Picea glauca)和黑云杉(P. mariana)作对比。他们用69个引物在该种中只检测到极低的遗传变异，而作为对照的2种云杉的变异性却要高得多。DeVerno等(1997)鉴于RAPD谱带中同源性问题所可能带来的一些误差，即多个不同的扩增产物因具有相同电泳迁移率而区别不开，而采用RAPD-RFLP方法对RAPD谱进行RFLP，结果64个引物限制酶组合中只有一个组合在供试材料中出现了多态的谱带式样，说明RAPD所反映的结果是基本可靠的，这些结果与以往等位酶所得结论是一致的，即脂松的遗传变异水平极低。Sulaiman等(1996)用RAPD标记揭示了喜马拉雅山区海拔4 000 m处2种濒危的绿绒蒿属(Meconpsis)植物的遗传均一性，指出在该属2个种内遗传多样性很低或缺少。Maguire等(1997)应用RAPD研究了珍稀濒危种Banksia cuneata的10个居群的遗传多样性，发现几乎所有的居群间的变异都来自于居群内个体的不同，同时表明鸟类传粉和高杂交率维持着B. cuneata居群间高的遗传多样性和内聚力。李春香等(1999)利用RAPD技术对四川、湖南、湖北交界处的27个水杉(Metasequoia glyptostroboides)进行了基因组DNA多态性分析，结果表明：水杉个体间的遗传距离与这些个体的地理分布相关；与松柏目其他类群相比，水杉居群的遗传多样性程度高于银杉(Cathaya argrophylla)(32%)，而在所处的大类群中则处中等水平。还由此推测孑遗植物的遗传多样性具有一定的变异范围。Prathepha等(1999)采集了6个地理上隔离的Afgekia sericea居群共269个样本，采用了73个RAPD分子标记对其进行了遗传多样性的研究，研究表明在A. sericea的居群间的遗传变异程度是很高的。罗光左等(2000)利用RAPD标记对鹅掌楸属(Liriodendron)2个现存种北美鹅掌楸(L. tulipifera)和鹅掌楸(L. chinense)的遗传多样性进行分析，结果表明：2个种都有较高的遗传多样性，但前者的遗传多样性水平高于后者；鹅掌楸的变异主要来自地理种源内，而北美鹅掌楸的变异主要来自地理种源间。Dactylanthus taylorii(Balanophoraceae)是新西兰的一种濒危的根瘤菌寄生的开花植物。Sebastian等(2002)采用RAPD技术分析D. taylorii的居群内和居群间遗传变异及地理差异与遗传分化的关系，研究结果表明该种的现有遗传特征是居群间长时间的隔离和居群内的基因流受到限制形成的，而不是人类影响的结果。

以上众多的研究结果均表明珍稀濒危植物在居群内和居群间都存在不同程度遗传衰退。在另一方面，对濒危物种遗传多样性的分析，可以为确定濒危物种的致危原因和积极的保护措施提供重要的依据。我国特有的濒危植物银杉曾经在欧亚大陆有广泛的分布，而现存的居群仅残留分布在广西、四川、湖南和贵州4省区的8个地点。由于其生长缓慢，结实量小，种子发芽率低，加上天然更新困难，正濒临灭绝(葛颂，1997)。Ge等(1998)根据12个酶系统25个等位酶位点对8个居群共101个个体的检测，发现该种具有低水平的遗传多样性，尤其在居群水平上，其遗传多样性水平只相当于其他裸子植物平均值的1/2~1/3，居群之间的分化也十分强烈，分化系数(G_st)高达0.441。汪小全等(1996)采用RAPD技术对该种4个地区共113个个体进行了分析，结果也发现居群水平上RAPDs的多态性低，居群间的变异占到总遗传变异的34.7%，提出低水平的遗传多样性可能是银杉濒危的原因之一。Du等(2002)运用RAPD技术对珍稀濒危植物海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis)在海南分布的5个自然居群的遗传多样性的研究表明：(1)海南粗榧的遗传多样性低，对环境适应能力差；(2)居群内和居群间遗传多样性差异显著；(3)过度砍伐、植被破坏、台风和遗传漂变是导致遗传多样性水平低下和致危的主要因素等。并建议选择遗传多样性高且破坏相对较小的黎母岭作为保护重点。Ranunculus reptans是生活于阿尔卑斯山湖边的一种只能通过无性繁殖的植物，由于湖水水位的变化，它的居群的数量和规模均呈下降的趋势。Markus等(1998)用RAPD技术研究了17个不同大小(1~10 000 m²)居群的遗传多样性，认为居群间的基因流是非常有限的，而且遗传漂变减小了小居群间的遗传变异。还提出保护该物种的遗传变异既需要大的居群，同时也需要小的居群(因为存在着居群差异)，而且可以通过增加小居群的大小来提高变异水平(以拮抗遗传漂变)。Rossetto等于1995年采用RAPD技术对澳大利亚西部山龙眼科(Proteaceae)的多年生木本Grevillea scapigera仅存的4个居群(共27个个体)的遗传多样性进行了研究，发现居群间几乎没有遗传差异，说明相互移植不会产生不利的遗传效应，同时根据实验结果可以确定需要优先保护的个体(转邹喻平等，2001)。Rossetto等(1999)采用RAPD技术对澳大利亚2种最稀有的桉树Eucalyptus phylacis和E. dolorosa进行研究发现，前者与其近缘种E. decipiens的3个亚种的亲缘关系很近，但遗传分化明显，是值得保护的遗传单元；而后者的遗传多样性明显高得多，这就为有针对性地对2个种采取相应的保护措施提供了依据。Olfelt等(1998)用RAPD方法研究了稀有植物Gentianella germanica的遗传变异的程度及居群大小与遗传变异的关系，研究结果表明G. germanica在自然居群中的基因流是十分有限的，而且在该种的小居群中植物适应性的降低最大的可能是由于遗传因素引起的，因此应扩大小居群的规模以减少遗传变异的丧失。苏应娟等(1999)对海南吊罗山的陆均松(Dacydium pierrei)不同居群进行RAPD分析，推测过度砍伐是造成陆均松渐危的原因。新疆野苹果(Malus sieversii)是栽培苹果(M. domestica；M. pumila)的主要亲本，目前已处于濒危状态。Geibel等(2000)利用SCAR和RAPD技术寻找新疆野苹果的抗病基因，达到了有效保护的目的。张恒庆等(2000)利用RAPD技术研究了凉水国家自然保护区天然红松(Pinus koraiensis)林的遗传变异水平及其分布规律，表明：与松科其他研究结果相比较，红松在DNA多态水平上表现出来的遗传多样性仅处于中等水平，保护现存天然红松林免受人类活动的干扰，是恢复和重建该地区红松阔叶林生态系统的当务之急。Hemigenia exilis(Lamiaceae)是澳大利亚西部的蛇纹岩土壤中生长的一种稀有植物，一度被认为已经灭绝，直到1995年在一个镍矿沉积物中被重新发现。Mattner等(2002)采用RAPD技术进行研究，结果表明H. exilis居群内的遗传多样性高于其它大多数本地物种，并据此提出保护的策略是维持高的遗传多样性和保护适应性强的地方居群。

此外了解濒危类群是否存在与近缘类群的杂交，对稀有濒危物种的保护也具有十分重要的意义。Rieseberg等(1995)采用RAPD技术对蔷薇科濒危乔木Cercocarpus traskiae 11株成年个体和5株推测的杂种幼苗及常见同属种C. betuloides var. blancheae进行杂种鉴定的基础上，提出了适合于濒危物种保护的具体措施，包括对濒危种的纯种个体进行无性繁殖和移栽到不会和近缘种杂交的地区，对该种的保护起到了十分积极的作用。Wong等(1999)用RAPD和等位酶技术对香港的一种兰科植物高斑叶兰(Goodyera procera)的15个居群的遗传变异和遗传结构进行研究，表明居群间的遗传多样性明显高于平均远交种，基因流仅存在于种内，据此提出合理的保护措施。Hogbin等(1999)采用RAPD技术对现存濒危物种芸香科(Rutaceae)的Zieria prostrata的4个居群进行了全面的遗传多样性检测和分析，从100个初试引物中筛选8个引物对全部132个采样个体进行检测，并辅之以主成分和AMOVA分析发现，尽管该4个居群仅分布于3 km的范围内，但居群间的遗传分化非常高(居群间遗传变异量占总变异量的37%)。他们将这种高水平的分化归结于该种可能具有自交的繁育系统、居群间的高度隔离以及遗传漂变的存在，并提出了相应的保护措施。

2.3 RAPD技术在系统进化方面的应用

在分类系统等级上，RAPD技术可通过遗传差异分析和遗传图谱的构建而对居群间、变种间、亚种间、种间乃至近缘属间的系统学方面进行研究，为分类学提供更可靠的依据。Stewart等(1996)利用RAPD技术并结合分子方差分析法研究了锦葵科(Malvaceae)的濒危种Illiamna corei和近缘种I. remota的遗传多样性及其之间的分类关系，根据种间差异不显著、种内居群间和居群内差异显著，认为应把前者处理为后者的亚种。王艇等(1999)利用随机扩增多态性DNA技术对三尖杉科(Cephalotaxaceae)植物三尖杉(Cephalotaxus fortunei)、粗榧(C. sinensis)、海南粗榧(C. hainanensis)和篦子三尖杉(C. oliveri)的系统发育进行探讨，其结果表明，篦子三尖杉与三尖杉属其他植物的亲缘关系较远，而支持篦子三尖杉独立成组的观点。王艇等(2000)利用RAPD技术对红豆杉科(Taxaceae)不同属的6种植物：红豆杉(Taxus chinensis)、南方红豆杉(Taxus chinensis var. mairei)、白豆杉(Pseudotaxus chienii)、穗花杉(Amentotaxus argotaenia)、云南穗花杉(Amentotaxus yunnanensis)和云南榧树(Torreya yunnanensis)进行系统学方面的分析，得出：(1)支持南方红豆杉作为变种的处理方式；(2)同意穗花杉属置于红豆杉科的观点；(3)白豆杉应为红豆杉科内的一个属白豆杉属(Pseudotaxus)，支持榧树族仅包括榧树属的观点。

3 RAPD技术在珍稀濒危植物研究和保护中的应用前景

RAPD技术不仅可以广泛应用于比较遗传多样性的复杂程度、探讨物种的系统发育情况及种质资源的鉴定等诸多方面，而且还为珍稀濒危植物的研究和保护提供了理论依据，因此RAPD技术在研究珍稀濒危植物遗传多样性方面有着广泛的应用前景。

目前任何一种分子标记方法或在理论上或在实际研究中都有各自的优点和缺陷，还找不到一种完全能替代其他方法的技术(Schaal et al., 1991)。RAPD技术也一样。首先，虽然RAPD可以被认为是一种共显性标记，但更多地把它认为是一种表型标记，无法直接用于基因型分析，这一缺陷可以借助其他标记手段(如同工酶)来弥补(Alfred et al., 1996)；其次，由于影响RAPD反应的因素很多，如PCR反应体系中模板浓度和质量、Mg²⁺浓度、dNTP浓度、引物G+C含量和浓度、TaqDNA酶纯度和用量、PCR仪性能、循环次数、温度设置、凝胶电泳的类别和胶的质量等，条件稍有变化，结果就不稳定。然而在应用过程中，只要操作人员认真负责，努力摸索最优的反应条件，优化反应体系和程序设计，完全可以得到重复性好、令人满意的结果(刘孟军，1995；汪小全等，1996)。随着RAPD技术的不断改进和对其成带理论的进一步深入了解，以及RAPD反应操作和数据处理方面自动化的逐步实现，RAPD分析方法在珍稀濒危物种致危机制、基因图谱方面的研究将更加深入，在居群遗传学和保护学方面的应用也会更加广泛和趋于成熟，这将使得对物种的保护，尤其是对濒危物种的保护上升到更高的层次。