林业科学  2002, Vol. 38 Issue (2): 92-97   PDF    
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邵志芳, 陈伟元, 罗焕亮, 叶新丰, 张景宁.
Shao Zhifang, Chen Weiyuan, Luo Huanliang, Ye Xin Feng, Zhang Jingning.
柞蚕抗菌肽D基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究
STUDIES ON THE INTRODUCTION OF THE CECROPIN D GENE INTO EUCALYPTUS UROPHYLLA TO BREED THE RESISTANT VARIETIES TO PSEUDOMONAS SOLANACEARUM
林业科学, 2002, 38(2): 92-97.
Scientia Silvae Sinicae, 2002, 38(2): 92-97.

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收稿日期：2000-03-05

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陈伟元
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邵志芳, 陈伟元, 罗焕亮, 叶新丰, 张景宁. 2002. 柞蚕抗菌肽D基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究. 林业科学, 38(2): 92-97.
Shao Zhifang, Chen Weiyuan, Luo Huanliang, Ye Xin Feng, Zhang Jingning. 2002. STUDIES ON THE INTRODUCTION OF THE CECROPIN D GENE INTO EUCALYPTUS UROPHYLLA TO BREED THE RESISTANT VARIETIES TO PSEUDOMONAS SOLANACEARUM. Scientia Silvae Sinicae, 38(2): 92-97.  
柞蚕抗菌肽D基因转化桉树培育抗青枯病株系的研究
邵志芳1 , 陈伟元2 , 罗焕亮3 , 叶新丰4 , 张景宁5     
1. 深圳市莲花山公园管理处 深圳 518036;
2. 深圳市梧桐山苗圃总场 深圳 518114;
3. 深圳出入境检验检疫局 深圳 518045;
4. 广东省肇庆林业局 肇庆 526040;
5. 华南农业大学 广州 510642
收稿日期：2000-03-05
基金项目：广东省自然科学基金资助, 编号: 950774
作者简介：罗焕亮现为华南理工大学食品与生物工程学院在职博士生.
摘要： 通过二次正交旋转组合设计对尾叶桉叶盘愈伤组织分化培养基优化,获得尾叶桉(Eucalyptus urophylia)叶盘外植体的再生植株。将携带外源目的基因的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)与尾叶桉U6无性系叶盘共培养,经愈伤组织诱导、卡那霉素筛选和植株再生,获得20个小芽,再将小芽转入附加卡那霉素(Kam) 40 μg·mL-1的E3-B培养基中诱根,获得8株存活且可再生的转化子。取转化苗叶片作胭脂碱合成酶活性检测电泳后呈阳性; 分别以γ-32 p-dCTP及地高辛标记柞蚕抗菌肽D基因作探针,与转化苗DNA作点杂交及Southern印迹杂交检测,结果均呈阳性。以上结果表明,柞蚕抗菌肽D基因已整合到尾叶桉基因组中。将从桉树青枯病重病区分离的强毒青枯菌(Pseudomonas spp.)株(991016)以1 ×109 cfu·mL -1浓度接种转化试管苗,以未经转基因的尾叶桉U6无性系试管苗为对照,结果表明转化苗接种死亡率56.7 %,对照死亡率为86.7%,由此可推出导入柞蚕抗菌肽D基因的尾叶桉转化苗明显提高了对青枯菌的抗性。
关键词： 尾叶桉    抗菌肽D    青枯病    柞蚕    
STUDIES ON THE INTRODUCTION OF THE CECROPIN D GENE INTO EUCALYPTUS UROPHYLLA TO BREED THE RESISTANT VARIETIES TO PSEUDOMONAS SOLANACEARUM
Shao Zhifang1, Chen Weiyuan2, Luo Huanliang3, Ye Xin Feng4, Zhang Jingning5     
1. Shenzhen Lianhuashan Park Shenzhen 518036;
2. Shenzhen Wutongshan Nurseries Shenzhen 518114;
3. Shenzhen Inspection and Quarantine Bureau Shenzhen 518045;
4. Zhaoqing Forestry Bureau Zhaoqing 526040;
5. South China Agricultural University Guanzhou 510642
Abstract: The leaf disc of Eucalyptus urophylla was regenerated by use of the quadratic orthogonal rotation design to optimize the differentiation medium for the callus. The leaf discs of the E. urophylla were co-cultivated with Agrobacterium tumefaciens carrying the target gene. 20 sprouts which resisted to the Kam were obtained after callus inducing and Kam sereening. 8 out of them regenerated from the rooting medium E3-B supplied with the same concentration of Kam can be considered as transgenic seedlings. The nopaline synthetic enzyme activity of the preliminary transformation was detected by electrophoresis. Using the anti-bacterial peptide gene labelled with γ-32p-dCTP or DIG as probes,the introduced gene was detected in the preliminary transformations through dot blotting and Southern blotting. Innoculation of the preliminary transgenic seedlings with high virulent Pseudomonas solanacearum (991016)caused a death rate of 56.7 %,30% lower than that of the control. It was demonstrated from the above results that the anti-bacterial peptide gene was integrated into the genome of Eucalyptus plant and the transgenic plant with higher resistance were obtained.
Key words: Eucalyptus urophylla    Cecropin D    Bacterial-wilt disease    Antheraea pernyi    

桉树(Eucalyptus)是国际公认的速生树种。我国桉树人工林面积达1.5 × 106hm2, 1982年, 在我国广西发现柳桉(E. saligna Smith)及巨桉(E. grandici Hill et Maid)人工林内发现青枯病(Pseudomonas sola nacearum E. F. Smith)以来(曹季丹, 1982), 时有发生, 备受其害, 特别是经济性状优良的无性系尤为严重, 甚至连片死亡。影响到某些无性系的推广。主要易感病的桉树有尾叶桉(E. urophylia Black)、巨尾桉(E. grandis ×E. urophylia)等发病率2 %~ 10 %, 严重时30 %~ 40 %(吴清平等, 1988)。目前, 在桉树青枯病难以用化学防治的情况下, 培育抗病品种是解决的根本措施。但目前的抗病品种资源选育尚未成功, 故拟用基因工程将某些抗病基因导入桉树以获得抗病的株系。

澳大利亚Forbio公司及CSTRO林业研究所等有桉树转基因的报道。有关学者用不同方法将外源基因转化于桉树获得瞬时表达, 尚未得到转基因植株(Teulieres et al., 1991; Manders et al., 1992; Moralejo, 1998; Sersano, 1996)其中利用根癌农杆菌(Agrobaclerum tecmefaciems) Ti质粒介导于尾叶桉及赤桉(E. camaldensis)的外植体中标出GUS基因及NPT Ⅱ基因等(Luciana de Oliveira, 1997; Mullins, 1997)。

笔者首次应用人工合成蚕抗菌肽(Cecropin) D基因通过根癌农杆菌介导于尾叶桉, 获得抗青枯病的转基因植株。抗菌肽是从中国柞蚕(Antheraea pernyi)蛹免疫血淋巴中分离的多肽, 具有广谱杀菌作用, 对桉树青枯病假单胞杆菌(Pseudomonas solanacearum E. F. Smith)有明显的杀灭效果(张景宁等, 1995)。根据抗菌肽的氨基酸序列设计合成其基因(徐飞等, 1988), 转入根癌农杆菌(李丹清等, 1990), 先后转化于烟草(黄自然等, 1992)、桑树(管志文等, 1994;王勇等, 1998)、水稻(简玉瑜等, 1997)均获得成功并遗传到子代具有抗病力。抗菌肽基因转化桉树可以通过无性繁殖大量获得抗青枯病的种苗, 预期是防治青枯病的新途径。

1 材料与方法 1.1 材料

供试的桉树品种为尾叶桉(E. urophylia) U6无性系, 由华南农业大学林学院森林培育教研室提供, 系青枯病感病品种。供试桉树青枯病假单孢杆菌(P. solanacearum) 991026、991016, 由华南农业大学林学院森保教研室提供。抗菌肽D基因及根癌农杆菌SE, 华南农业大学蚕业服装系生物技术室提供。

1.2 方法 1.2.1 尾叶桉组织培养及植株再生

从无菌苗中剪取叶盘2 ~ 3 mm2, 接种于表 1培养基中诱导产生愈伤组织。采用二次正交旋转组合法(唐启义等, 1997)设计, 调查愈伤组织诱发芽体的最佳配方。从诱导分化苗中筛选E3-A及E3-B培养基诱导生根。最后将生根良好的组培苗, 经1000 mg·L-1 KMnO4液消毒后移入炼基质中, 经10 ~ 14 d成活。

表 1 用于尾叶桉叶盘愈伤组织诱导试验的培养基 Tab.1 The medium used for callus inducing test of E. urophlla
1.2.2 抗菌肽D基因转化桉树

含抗菌肽D基因的根癌农杆菌Se, 感染桉树叶盘, 在MS固体培养基中预培养2 d, 分别转入含不同浓度的头孢酶素(Cef)及卡那霉素(Kam)的MS培养基中, 筛选转化子。按1.2.1的方法获得转基因植株(黄自然等, 1992;管志文等, 1994)。

1.2.3 转基因植株的检测

转基因植株中胭脂碱合成酶基因的检测, 按许耀(1987)及蒋兴邦的(1986)方法进行。地高辛(DIG)标记抗菌肽D基因作探针, 按照试剂盒中说明书进行。对转基因桉树的DNA进行点杂交及Southern Blotting检测(Sambrook et al., 1989)。

1.2.4 转基因植株抗青枯病的抗性鉴定

桉树青枯病假单孢杆菌991016、991026系在广东省雷州市采集分离纯化的, 具有较强致病力。浸根法接种:先将待测的试管苗用剪刀剪伤部分须根, 用1 ×109cfu· mL-1的菌液浸渍后移入培养基瓶中培养。对照为同期培养的无菌幼苗, 调查发病情况。

2 结果与分析 2.1 尾叶桉叶盘愈伤组织诱导及植株再生 2.1.1 愈伤组织诱导

从无菌苗中剪取叶盘接种于不同MS培养基中, 其中以E2-B培养基(MS +6-BA 0.2mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1)效果最好。约经9 d可分化出愈伤组织, 其生长致密、呈绿色、表面有突起, 长势旺盛, 经20 ~ 30 d可转入分化培养基。

2.1.2 愈伤组织分化不定芽

用二次正交旋转组合设计方案进行优选培养基配方, 经DPS数据处理软件分析。调查每块愈伤组织分化的不定芽数。设计方案中因素及其变化区设置如下:因素1(X1) 6-BA零水平为0.8 mg·L-1, 变化区为0.2 mg·L-1;因素2(X2) NAA零水平为0.3 mg·L-1, 变化区为0.3 mg· L-1; MS培养基中Ca2+的浓度对分化有一定影响, 故以Ca2+的浓度为因素3(X3)以常规MS培养基中Ca2+浓度为零水平, 以常规浓度的1/4为变化区。从分化芽的统计结果进行回归方差分析, 在回归模型中模拟寻优得出最佳配方。即当Ca2+浓度为MS培养基常规量的0.56倍时, 加入6-BA 0.46 mg·L-1、NAA0.13 mg·L-1, 愈伤组织的诱芽率(y)达最大值每块4.47个。

2.1.3 幼芽诱导生根

设计诱导生根培养基是E3-A(1/2MS +NAA0.1mg·L-1 +IBA0.1mg·L-1)及E3-B (1/2MS +NAA0.5mg·L-1 +IBA0.5mg·L-1), 分别将长约2 ~ 3 cm的不定芽接入诱根培养基中, 发根时间为6 ~ 8 d, 生根率均达90 %以上。E3-A诱导发根数较多但偏弱, 不利于移植, E3-B发根虽偏少, 但较粗壮, 移植成活率较高, 故选定E3-B作为生根培养基, 获得尾叶桉叶盘外植体经愈伤再生的植株(图版Ⅰ-1)。

图版Ⅰ   Plate Ⅰ   Ⅰ-1尾叶桉叶盘外植体经愈伤再生的完整植株; Ⅰ-2卡那霉素对桉树叶盘生长分化的影响左图示Kam浓度为40μ g·mL-1的生长表现, 右图示Kam浓度为50μ g·mL-1的生长表现; Ⅰ-3头孢霉素对桉树叶盘生长分化的影响, 左图示Cef浓度为700μ g·mL-1的生长表现, 右图示Cef浓度为1100μ g·mL-1的生长表现; Ⅰ-4转基因桉树叶盘愈伤组织分化不定芽; Ⅰ-5转基因桉树诱导生根; Ⅰ-6转基因桉树移栽苗; Ⅰ-7转基因桉树对青枯病的抗病力检测, A :培养瓶接种15 d结果, 左瓶为对照, 右瓶为转基因植株; B:左示对照接种植株根变黑, 右示转基因植株根部正常。 Ⅰ-1 The E. urophylia plant regenerated from the leaf disc through callus inducing; Ⅰ-2 The influence of Kam on the growth of leaf disc of E. urophylia. In the left was under 40μ g·mL-1 and in the right was that of 50μ g·mL-1; Ⅰ-3 The influence of Cef concentration on the growth of leaf dise of E. urophylia. In the left one was under 70μ g·mL-1 and in the right was that of 1100μ g·mL-1; Ⅰ-4 The adentitious bud was induced on the callus from the trangenic leaf disc of E. urophylla; Ⅰ-5 The adentitious bud was rooting on the rooted medium; Ⅰ-6 The E. urophylia trangenic seedling with cecropin gene; Ⅰ-7 The resistance test of transgenic seedling to Pseudomonas solanacearum. A shows the inoculation in the bottie, in the right was the control and in the le af was the transgenic seedling. B : In the left showed the black root of the control, in the right the root of the transgenic seedling remained normal.
2.2 桉树叶盘对卡那霉素及头孢霉素的敏感试验

抗菌肽D基因载体Co24含有新霉素磷酸酶基因(NPT-Ⅱ), 对Kam起解毒作用, 用不同浓度Kam的培养基以筛选转化子, 同时用不同浓度Cef以抑制残余的农杆菌的生长。结果见表 2、3及图版Ⅰ-2、Ⅰ-3, 其中每一浓度统计30个组织块, 以80 %(即24个)以上的组织块所具有的共同特征表示该浓度的生长分化情况。

表 2 桉树叶盘对卡那霉素的敏感性试验 Tab.2 The sensitive test of E. urophylia to Kam
表 3 桉树叶盘对头孢霉素的敏感性试验 Tab.3 The sensitive test of E. urophylia to Cef

试验提示卡那霉素40 μ g·mL-1的浓度是临界点, 叶盘所诱导产生的愈伤组织色绿、较致密, 可满足分化不定芽的要求。头孢霉素700 μ g·mL-1的浓度足以抑制农杆菌而对叶盘无不良影响。为使试验顺利进行, 第1批有效抑制农杆菌生长后, 可渐次降低头孢霉素的浓度, 以利叶盘的分化。

2.2 抗菌肽D基因转化苗的获得及鉴定 2.3.1 转基因苗的筛选

经头孢霉素及卡那霉素的筛选, 在诱导培养基(E1-B)中培养20d开始形成愈伤组织, 待生长稳定体积增大后, 作第1次继代, 待长至旺盛期后转入分化培养基(E1-A)以诱导分化不定芽, 由于卡那霉素的影响, 部分幼芽变黄, 而绿色的幼芽则可长成幼苗。待不定芽长至1.2 ~ 3.0 cm时, 转入含临界浓度卡那霉素的诱根培养基(E3-B)以诱导生根。本实验共获得20株小苗, 其中8株能再生成完整的植株, 占40 %。见图版Ⅰ-4、Ⅰ-5、Ⅰ-6。

2.3.2 转基因桉树的鉴定

胭脂碱的检测:抗菌肽D基因载体Co24质粒中含有胭脂碱合成酶基因, 处于抗菌肽D基因下游, 电泳检测结果见图 1。表明转基因桉树呈阳性反应。

图 1 转化苗胭脂碱电泳检测结果 Fig. 1 The electrophoresis result of Nopline from trangenic seedling 1:标准胭脂碱、精氨酸混合物(NOP+Arg); 2 ~ 4: KamR苗, 其中2、3呈阳性, 4呈阴性KamR seedling, 2 and 3 were positive and 4is negative; 5:非转化桉树植株(阴性对照)Non-transgenic seedling (control)

DNA点印迹杂交及Southern印迹杂交:取胭脂碱阳性反应的植株, 用α-32P-dCTP标记的抗菌肽D基因作探针, 对转基因苗的DNA作点杂交。见图 2、3, 结果表明转基因桉树呈阳性反应。然后用地高辛(DIG)标记的抗菌肽D基因作探针, 进行Southern印迹杂交亦呈阳性, 见图 4、5。

图 2 抗菌肽基因转化菌DNA点杂交(α-32 P-dCTP标记)检测 Fig. 2 The dot blotting result of transgenic seedling with probe labelled with α-32P-dCTP 1. Co24重组质粒(阳性对照) 1. Co24 recombinant plasmid (positive control) 2, 3.转基因桉树植株Transgenic seedling; 4.非转化桉树植株(阴性对照) Non-transgenic seedling (negative control)
图 3 抗菌肽基因转化苗DNA点杂交(DIG标记)检测 Fig. 3 The dot blotting result of transgenic seedling with probe labelled with DIG 1.非转化桉树植株(阴性对照) Non transgenic seedling (negative control); 2. Co24重组质粒(阳性对照) Co24 recombinant plasmid(positive control); 3~ 5.转基因桉树植株Transgenic seedling
图 4 转化苗DNA Southern杂交检测(α-32P-dCTP标记) Fig. 4 The southern blotting result of DNA from transgenic seedling with probe labelled with α-32P-dCTP 1. Co24重组质粒(阳性对照)Co24 recombinant plasmid(positive control); 2.非转化桉树植株(阴性对照)Non-transgenic seedling (negative control); 3.转基因桉树植株Transgenic seedling
图 5 转化苗DNA Southern杂交检测(DIG标记) Fig. 5 The Southern blotting result of DNA from transgenic seedling with probe labelled with DIG 1. Co24重组质粒(阳性对照) Co24 recombinant plasmid(positive control); ; 2~ 3.转基因桉树植株Transgenic seedling; 4.非转化桉树植株(阴性对照) Non-transgenic seedling(negative control)
2.3 转基因桉树对青枯病抗性的检测

将第1批8株呈Southern印迹杂交阳性的植株进行无性繁殖获得一批小苗。随机取30株, 另取15株非转基因植株作对照。用浸根法接种桉树青枯病假单孢杆菌(1 ×109 cfu·mL-1), 30 ±1 ℃, 1000 lx下培养7 d, 两者无大差异, 10 d后, 对照区发病10株, 转基因区没有明显症状; 30 d后, 对照区仅存活2株, 转基因区存活13株。见图版Ⅰ-7, 对照区发病率86.7 %, 转基因桉树为56.7 %, 而且发病期延缓。

试验结果表明, 抗菌肽D基因通过根癌农杆菌介导于尾叶桉树叶盘, 诱导成苗, 经卡那霉素筛选转化子, 通过胭脂碱、点杂交及Southern印迹杂交, 证明抗菌肽D基因整合到桉树基因组中。接种青枯菌后30d存活率达43.3 %, 较对照区(13.3 %)明显提高, 且发病较慢。说明转基因桉树提高了其对青枯病的抗病力。

3 讨论

外源基因对木本植物的遗传转化已在桑树1)(管志文等, 1994;王勇等, 1998)柑桔(陈善春等, 1997)、杨树(李强等, 1996)等木本植物获得成功, 其成功的关键在于建立与之相关的植株组织培养再生技术。本文结合前人在桉树组织培养方面的经验, 应用二次正交旋转组合设计对再生体系进行优化, 获得比较理想的结果, 为下一步的目的基因转化奠定基础, 也说明本文的结果是可行的。

对植物青枯病的致死性, 我们一般认为是由于细菌在植物导管中大量繁殖, 堵塞导管影响水分运输而使植物致死。而本文获得的抗菌肽基因的转化株对青枯病的抗性, 是由于其产生的抗菌肽向导管分泌抑杀细菌, 还是由于抗菌肽存在于根部的活细胞阻碍青枯菌的侵入或其他机理尚有待进一步的研究。Sophia等(1999)及Carl等(1999)最新的研究结果表明, 从昆虫中获得的抗菌肽不但具有抗细菌的作用, 而且具有抗真菌的作用, 由此可推测, 本研究在获得的抗青枯病的桉树转化子的同时, 也是对桉树真菌病害的预防。

转化子中外源基因能否保持及遗传的问题也是值得注意的。从目前的结果看, 经二次继代仍可获得目的基因。Mullins等(1997)认为无性繁殖是对外源基因的遗传性优先保留的方法, 因为有性选育的时间长且由于产生姐妹染色体的交叉互换, 很容易导致目的基因的丢失或基因功能的稀释。目前, 该桉树在生产上主要以无性繁殖为主, 因而, 对外源目的基因的保持及遗传是有利的, 但尚须经多代的跟踪检测。

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