对于生物来说, 磁场是一种物理刺激因素。国内外已有不少研究证明磁场的生物效应是多种多样的, 在生物的浸种、发芽、发育和生长的某一阶段或某几个阶段中施加磁场处理, 常出现许多值得注意的现象和效应(李国栋, 1978; 1983; 林韶湘, 1983; 贾媛等, 2000)。关于磁场对微生物的影响也有不少的报导, 如磁场会影响酵母菌的生长及其代谢(丁一倪等, 1973); 磁场对土壤微生物和酶活性有影响(张吉先等, 1999); 适当的磁场强度和处理时间, 能加快白僵菌菌丝生长和提高产孢量等等(杨敏芝等, 1998)。而磁化水的生物效应是生物磁学的重要组成部分, 也是微生物磁学中有待开拓的新领域。对于磁化水的生物效应, 文献报道以处理植物者为多, 对微生物的影响报道较少(李国栋, 1983; 尤华明, 1997; 尤华明等, 1998; 阳葵等, 1999)。因此, 本文着重从宏观效应上研究磁化水对绿僵菌液生分生孢子形成的影响, 及其产生的液生分生孢子对马尾松毛虫的毒力, 这是一次新的尝试, 旨在探索磁化水在液体发酵生产菌剂中的应用价值和提供一个简单易行、经济有效的新技术。

1 材料和方法 1.1 供试菌种

金龟子系僵菌[Metarrhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin], M337、M103、M104;贵州绿僵菌(Metarrhizium guizhouense Chen et Guo), M115。以上菌种均来源于中国农业菌种保藏中心。

1.2 磁化水生产

使用福建省南平科力磁生物应用技术研究所出品的长磁程蛇管式流体磁化器生产磁化水。

1.3 培养基成分

蔗糖、豆饼粉、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂、H₃BO₃、MnSO₄·4H₂O、Na₂MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、FeCl₃·6H₂O、复合维生素B、吐温-80、磁化水。另设非磁化水(普通水)培养基为对照。

1.4 试验方法

取供试斜面菌种加0.1%吐温-80无菌水, 用无菌操作打散混匀、稀释, 使其最终含孢量为1×10⁹个孢子·L^-1。250 mL三角瓶装入49 mL培养液, 接入1 mL孢子悬浮液, 设3个重复, 置(25±1) ℃恒温摇床中振荡培养120 h, 振荡频率为130 r·min^-1。液生分生孢子用血球计数板计数, 生物量用干物质称量法测定, 即将培养液过滤, 120℃烘干2 h, 称重。

1.5 液生分生孢子对马尾松毛虫的毒力测定

将M337菌株接种于上述最佳的磁化水培养基和非磁化水培养基中, 置25±1℃、振荡频率为130 r·min^-1的恒温摇床中振荡培养144 h, 大量形成液生分生孢子, 然后分别滤除菌丝体, 再经离心收集液生分生孢子, 然后用无菌水配制成浓度梯度分别为:1.0×10¹¹~1.0×10⁷个孢子·L^-1的液生分生孢子悬浮液。每种浓度设3个重复, 每个重复30条3~4龄马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus Walker)。用微量注射器吸取上述菌液滴于幼虫体表, 每虫接种量为0.1 mL菌液, 对照组用无菌水接种。处理后放入装有松针的罐头瓶中, 瓶盖装有铁丝网, 以保持通气, 置于25℃下饲养。每日更换松针, 喷清水以保持高湿, 逐日统计感染死亡虫数。

2 结果和分析 2.1 磁化水对绿僵菌液生分生孢子形成和生物量的影响

供试的3株绿僵菌(M337, M103, M104)和1株贵州绿僵菌(M115)在液体振荡培养24 h后, 分生孢子开始萌发, 原生质转移至芽管生长点, 芽管自孢子一端或两端伸出。48 h菌体形成细小的菌丝团。72 h芽孢子开始大量形成, 芽孢子呈长卵形, 并有部分芽孢子以微循环产孢方式, 不经营养生长阶段, 直接从芽孢子上形成分生孢子, 液生分生孢子卵球形, 与气生分生孢子有明显差异。此后大量的液生分生孢子不断以微循环产孢方式从芽孢子上形成, 液生分生孢子产量逐渐增加, 120~144 h达到最高产孢量。

表 1为绿僵菌各菌株在不同磁化强度磁化水培养基中振荡培养120 h后液生分生孢子产量和生物量(生物量包含孢子和菌丝, 但从重量上看, 孢子所占比重很小, 几乎可以忽略)情况。经方差分析可知, 磁化水对绿僵菌生物量无显著影响[F=1.71 < F_0.05 (7, 21) =2.49], 对液生分生孢子形成影响显著[F=3.01>F_0.05 (7, 21) =2.49], 经SSR检验可知(表 2), 磁化区磁场强度在0.30~0.32T、0.38~0.40T和0.53~0.55T的磁化器产生的磁化水明显有利于绿僵菌液生分生孢子的形成, 其中以磁化区磁场强度在0.38~0.40T的磁化器(KL-Ⅳ)产生的磁化水对液生分生孢子形成影响最大, 用这种磁化水配制的培养基可获得最大的产孢量。然而, 不同菌株对磁化水的磁生物效应表现出明显的差异性。磁化水对M337和M103菌株的刺激效应较强, 而对M104和M115菌株却未见有明显的影响, 其原因有待进一步研究和探讨。从试验结果可以看出, 适当磁化强度的磁化水能有效刺激M337和M103菌株液生分生孢子的形成, 但对生物量并无明显影响, 相反, 生物量还略低于对照, 其原因是M337和M103菌株在这些磁化水培养基中所形成的菌丝团要比在对照培养基中形成的菌丝团小, 所以最终的生物量就比对照的低。以往的研究证明, 在液体深层培养过程中适当控制绿僵菌的菌丝生长, 尽可能获得发育良好的细小菌丝团, 比大型的球状菌丝团能更好、更多的产孢(Adámek, 1965; 宋漳等, 2000)。

2.2 液生分生孢子对马尾松毛虫的毒力

以M337菌株作为供试菌种, 将M337菌株接种于上述最佳的磁化水培养基和非磁化水培养基中振荡培养, 待大量形成液生分生孢子后, 分别滤除菌丝体, 将含有孢子的滤液经离心收集液生分生孢子对3~4龄马尾松毛虫幼虫进行毒力测定。液生分生孢子接种处理2 d后松毛虫幼虫开始死亡, 随后整个虫尸被白色菌丝体覆盖, 数天后出现典型的绿色僵虫症状, 侵染12 d后的死亡情况见表 3。LC₅₀采用张宗炳方法计算(张宗炳, 1988), 结果得到死亡率(用机率值)与感染浓度(用对数值)的回归方程和LC₅₀ (见表 4), LT₅₀的计算结果见表 5。综合分析LC₅₀、LT₅₀和回归方程的斜率b可以看出, 用磁化水培养基生产的和用非磁化水培养基生产的液生分生孢子对马尾松毛虫的毒力相差无几, 并无显著差异。

3 小结与讨论

研究结果表明, 磁化水对供试的3株金龟子绿僵菌(M337、M107、M104)和1株贵州绿僵菌(M115)的液生分生孢子的形成影响显著, 但对绿僵菌生物量无显著影响。适当磁化强度的磁化水能显著提高绿僵菌液生分生孢子产量, 但不同菌株对磁化水的生物效应表现出明显的差异性, 其原因尚有待进一步研究。从M337菌株室内毒力测定结果来看, 用磁化水生产的液生分生孢子和用非磁化水(普通水)生产的液生分生孢子对马尾松毛虫的的毒力并无显著差异。

绿僵菌液生孢子的形成方式和产量与培养基的营养成分和培养条件密切相关(Adámek, 1965; Campbell et al., 1978; 樊美珍等, 1993; 宋漳, 1996; 1997; 2000)。由于磁化水的缔合度减小, 渗透压增加, 使水分和养分更容易渗透到细胞内, 使细胞内酶的活性增加, 从而影响与这些酶有关的生化反应和生理过程, 对微生物的活动、生长和繁殖产生积极的作用(李国栋, 1983; 尤华明, 1998), 这也许就是磁化水能提高某些绿僵菌菌株液生分生孢子产量的原因之一。然而, 磁化水的生物效应是一个十分复杂的过程, 我们对磁化水生物效应的了解十分缺乏, 因而很有必要对磁化水的作用机制做进一步的探讨和研究。另亦有研究资料表明(阳葵等, 1999), 绿僵菌菌种经磁化水处理后, 菌种的优良特性可在传代中保持至第3代。因此, 笔者认为磁化水在绿僵菌菌剂生产和防止菌种退化问题上有潜在的应用价值。