小蠹虫是天然森林生态系统中毁灭性的害虫, 不仅能够充分地利用寄主树木所提供的生态空间(陈辉, 1999;Graham, 1967), 而且能够通过与森林生态系统中各种因素的相互作用, 利用树木潜在的食物资源, 这种能力在很大程度上取决于小蠹虫与特定微生物间的互惠联系(Graham, 1967)。许多研究证实, 小蠹虫与微生物间存在着密切的联系, Whitney (1982)将与小蠹虫相关的微生物分为共生和非共生两大类群(Whitney, 1982)。小蠹虫与微生物的共生不仅表现在小蠹虫与微生物间的互惠联系, 而且表现在小蠹虫对微生物的适应进化所形成的特殊带菌结构上。小蠹虫体外的贮菌器是携带和传播共生真菌的主要结构, 也是小蠹虫与真菌建立共生联系的主要媒介(Barras et al., 1992;Graham, 1967;Happ et al., 1976;Paine et al., 1997;Whitney, 1982)。目前许多小蠹虫贮菌器结构已被发现, 而我国小蠹虫贮菌器结构却未曾有人研究。本研究旨在通过对秦岭林区华山松大小蠹(Dendroctonus armandi Tsai et Li)贮菌器结构和携带真菌机制的研究, 揭示该林区华山松大小蠹与真菌共生的机制和健康华山松被害死亡的内在原因。

1 材料和方法 1.1 供试虫源

在海拔1600~2200 m的秦岭林区华山松林中, 选择各被害阶段(新侵木、枯萎木、枯立木)寄主树木, 在树干基部至树干中部华山松大小蠹入侵繁殖区域内, 取出新羽化的成虫, 装入无菌袋内; 同时截取1 m长各被害阶段华山松树干, 带回室内, 收集羽化飞出的成虫, 并取出华山松大小蠹幼虫和蛹。供室内解剖、分离真菌和制备扫描电镜样品。

1.2 华山松大小蠹体内外真菌分离

将取出的华山松大小蠹和室内木段羽化的成虫, 在无菌条件下解剖其各体段和附肢, 采用Francke-Grosmann间歇灭菌法分离华山松大小蠹成虫体外真菌(Francke, 1967), 同时单孢分离华山松大小蠹成虫贮菌器内真菌。

将室内木段中取出的华山松大小蠹成虫和幼虫, 经1%次氯酸钠、70%酒精清洗消毒, 研碎划线于PDA培养基上; 将表面消毒后的华山松大小蠹成虫, 无菌下剖取消化道, 研碎分离培养。将取出的华山松大小蠹成虫, 放置在无菌培养皿内, 20℃下饥饿48 h, 经表面消毒后分离培养; 取培养皿内华山松大小蠹成虫排泄物, 用灭菌蒸馏水稀释后分离。

1.3 华山松大小蠹虫体组织切片

将取得的华山松大小蠹幼虫和成虫, 经生理盐水清洗后, 用Bouin固定液固定12~24 h, 剖取消化道, 进行常规石蜡切片(切片厚度6~8μm), 切片用Gridley法染色(芮菊生等, 1980)。

1.4 华山松大小蠹贮菌器扫描电镜观察

将野外取得的华山松大小蠹成虫和室内孵育羽化的华山松大小蠹成虫, 分各体段解剖, 经喷金处理后, 用Hitachi S-450型扫描电镜观察。

2 结果与分析 2.1 华山松大小蠹体内外携带真菌的种类和带菌部位 2.1.1 华山松大小蠹体外携带真菌种类

对华山松大小蠹成虫体外真菌的分离, 结果表明:华山松大小蠹成虫体外携带或附着着许多的真菌种类, 分别隶属于线嘴壳属(Ophiostoma)、青霉属(Pencillium)、曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、链格孢属(Alternaria)、头孢霉属(Cephalosporium)、细帚霉属(Leptographium)等。从华山松大小蠹成虫体外真菌的分布看:华山松大小蠹成虫头壳、下颚、前胸背板、前足基节和鞘翅等处携带和附着大量的真菌, 其中以前胸背板携带和附着的真菌密度最高。

对饥饿48 h后的华山松大小蠹成虫的Francke-Grosmann间歇灭菌, 则分离不到任何真菌, 这表明华山松大小蠹成虫体表没有特殊的腺细胞, 分泌油脂以保护所携带真菌的孢子或菌体。

2.1.2 华山松大小蠹消化道结构及消化道内真菌种类

(1) 华山松大小蠹消化道结构通过对华山松大小蠹成虫、幼虫消化道的解剖可以看出:华山松大小蠹成虫和幼虫消化道中具有膨大的嗉囊和发达的前胃, 前胃与嗉囊间分界不明显。通过切片可以看出在华山松大小蠹消化道中没有贮菌囊、含菌细胞以及含菌体, 以供微生物在华山松大小蠹消化系统中附着或共生; (2)华山松大小蠹消化道内真菌种类从华山松大小蠹消化道的石蜡切片看, 在华山松大小蠹成虫和幼虫消化道中肠内有真菌的菌丝和孢子, 经分离培养表明这些真菌分别隶属于线嘴壳属(Ophiostoma)、链格孢属(Alternaria)、青霉属(Pencillium)、毕赤酵母属(Pichia)和细帚霉属(Leptographium)。在华山松大小蠹幼虫中肠内, 真菌主要以菌丝形态存在, 而在华山松大小蠹成虫中肠内, 除有大量的真菌菌丝外, 还存在大量的真菌孢子。这说明秦岭林区华山松大小蠹与相关真菌在发育阶段上具有相对的时间一致性。从华山松大小蠹成虫和幼虫中肠内真菌与肠壁的关系看, 存在于华山松大小蠹成虫和幼虫中肠内的真菌菌丝密布于消化道内食物组织中, 着生孢子的孢子梗或菌丝是由食物组织中较为发达的真菌菌丝发育而来。华山松大小蠹中肠内的真菌没有菌丝特化形成的附着孢或吸盘等结构, 以有效地将真菌菌丝或孢子附着在华山松大小蠹成虫和幼虫肠壁上。

通过对饥饿48 h后的华山松大小蠹成虫和幼虫消化道的解剖、石蜡切片观察和真菌的分离结果表明:饥饿后华山松大小蠹成虫和幼虫消化道已成为空腔, 不但在华山松大小蠹消化道内不存在食物组织和真菌的菌丝或孢子, 而且也分离不到任何真菌。这进一步说明存在于华山松大小蠹成虫和幼虫消化道内的真菌, 是随华山松大小蠹在寄主韧皮部和木质部间的取食而进入消化道内的, 在华山松大小蠹消化道内不存在与真菌的共生关系。

2.2 华山松大小蠹贮菌器结构 2.2.1 华山松大小蠹贮菌器结构和存在部位

对华山松大小蠹成虫扫描电镜的观察结果表明:在华山松大小蠹成虫前胸背板和前足基节的刺毛基部和体表凹陷内及周缘附着大量近圆形和纺锤形的真菌孢子。其中在华山松大小蠹成虫体壁刺毛基部的真菌孢子多以单独散生状态存在, 而在华山松大小蠹成虫体壁凹陷内的真菌孢子, 则主要以聚集状态粘结在一起(图 1)。

从华山松大小蠹成虫体外贮菌器的结构、部位和携带真菌孢子的数量看:前胸背板刺毛和凹陷处携带真菌孢子的数量最大, 而华山松大小蠹成虫前足基节和鞘翅处真菌孢子的数量较少。这表明华山松大小蠹成虫前胸背板的凹陷和刺毛是华山松大小蠹携带真菌的主要部位, 即华山松大小蠹贮菌器存在部位。

从华山松大小蠹所携带真菌菌体的发育阶段看, 在华山松大小蠹体壁各部位均没有发现真菌的菌丝, 这说明真菌孢子是华山松大小蠹体外贮存和携带真菌的唯一物体。

从华山松大小蠹成虫体壁各部位结构看, 尽管华山松大小蠹成虫鞘翅上有大量成排的凹陷、华山松大小蠹成虫前胸背板前缘有成排的刺毛和前足腿节上有大量的刺毛, 但在这些刺毛基部和凹陷内均没有真菌的菌丝和孢子。这表明华山松大小蠹与其携带的真菌, 不仅在贮存和携带真菌菌体的部位上具有形态结构的适应性, 而且华山松大小蠹在携带真菌菌体的阶段上具有明显的选择适应性。这种形态结构的适应性, 使华山松大小蠹在自然扩散和迁移过程中能够有效地维持真菌的活性。而华山松大小蠹在携带真菌菌体阶段上的选择适应性, 使华山松大小蠹成虫在选择入侵健康寄主树木的同时能有效地接种真菌孢子于寄主树木组织内。

2.2.2 华山松大小蠹贮菌器内真菌的种类

对华山松大小蠹成虫头壳、前胸背板、下颚和前足基节贮菌器内真菌的单孢分离鉴定, 结果表明:华山松大小蠹成虫贮菌器内真菌主要为小线嘴壳Ophiostoma minus和穿孔细帚霉Leptographium terebrabtis, 而以后者的孢子在华山松大小蠹成虫前胸背板贮菌器中携带的密度最高。从华山松大小蠹成虫体外贮菌器中真菌孢子的形态和大小看, 华山松大小蠹成虫前胸背板贮菌器中的真菌孢子大小和形态与被害华山松树木组织内分离的真菌完全一致, 主要是穿孔细帚霉的孢子, 而小线嘴壳的孢子在贮菌器中的数量和携带频率很低。此外, 在华山松大小蠹成虫前胸背板偶尔也存在链格孢属(Alternaria)真菌孢子, 但由于孢子个体较大, 无法在华山松大小蠹成虫体外贮菌器中贮存和携带, 这说明链格孢属真菌并非华山松大小蠹成虫贮菌器携带和传播的真菌种类(图 1d)。

2.3 华山松大小蠹携带真菌的机制

从华山松大小蠹贮菌器存在的部位、结构、贮菌器内真菌的发育阶段和寄主华山松组织内真菌的发育, 可以得出秦岭华山松大小蠹携带真菌的机制为:首先, 华山松大小蠹在入侵健康寄主华山松时将成虫贮菌器携带的真菌孢子接种于华山松树干组织内, 被接种的真菌其营养生长(即菌丝生长)主要在寄主华山松木质部边材组织内进行, 而生殖生长(即孢子发育)则主要在华山松大小蠹坑道的蛹室内发育。其次, 华山松大小蠹成虫在羽化后蛀食羽化孔时, 将坑道内真菌孢子携带和贮存于体外贮菌器内。最后, 华山松大小蠹成虫作为唯一主动迁移的阶段的虫态, 通过对秦岭华山松生态系统中寄主华山松的选择和入侵, 将其体外贮菌器中携带的真菌, 以孢子方式接种于健康华山松树干组织内。这样循环往复使华山松大小蠹和其携带的真菌建立起永久的联系。

3 结论与讨论

华山松大小蠹成虫作为唯一入侵健康寄主华山松的虫态, 具有前胸背板体壁凹陷和刺毛构成的贮菌器, 以真菌孢子为唯一携带物体, 以穿孔细帚霉和小线嘴壳为主要携带真菌种类; 华山松大小蠹成虫贮菌器内没有腺细胞, 不能分泌油脂以保护所携带真菌的孢子; 华山松大小蠹成虫消化道内没有含菌细胞和特化的带菌结构, 消化道并非真菌共生的场所, 真菌的传播也不依赖于华山松大小蠹消化系统。华山松大小蠹与真菌的关系是通过华山松大小蠹体表携带真菌而建立起来的。存在于华山松大小蠹成虫和幼虫消化道内的真菌, 是随华山松大小蠹在寄主韧皮部和木质部间的取食, 而进入消化道内的。

华山松大小蠹成虫贮菌器的存在部位和结构与大小蠹属墨西哥松大小蠹(Dendroctonus approximatus)、南松大小蠹(Dendroctonus frontalis)、西松大小蠹(Dendroctonus brevicomis)和圆头松大小蠹(Dendroctonus adjunctus)相似(Barras et al., 1972;1971;Happ et al., 1976;1975;Paine, 1997)。但在贮菌器存在的部位上与小蠹属弱瘤小蠹(Scolytus ventralis)和毛小蠹属西部香脂冷杉毛小蠹(Dryocoetes confusus)有明显的差异; 在贮菌器结构上与长小蠹科梣长小蠹Platypus severini差异更大(Nakshima, 1982)。这说明小蠹科昆虫同一类群昆虫(如同属)不仅在贮菌器结构和存在部位上具有相似性, 而且大小蠹属昆虫在形态结构和发育进程上具有携带传播真菌的适应性。

华山松大小蠹对寄主树木的选择入侵以及在寄主树木内的定居和繁衍与真菌具有时间和发育的一致性, 这就使华山松大小蠹能够在成虫阶段, 通过主动迁移和扩散, 达到对真菌的有效传播, 并通过华山松大小蠹成虫选择入侵健康寄主树木, 将体外携带的真菌接种到寄主木质部和韧皮部组织内。入侵寄主华山松木质部的真菌, 其菌丝在华山松木质部边材树脂道内及管胞细胞间和管胞细胞内蔓延, 并成束地生长于树脂道内, 破坏华山松木质部树脂道泌脂细胞, 堵塞树脂道, 使被害华山松树脂分泌系统失去抗性。同时, 入侵的真菌菌丝通过在华山松木质部管胞细胞间和管胞细胞内的生长, 抑制华山松木质部管胞细胞的输导能力, 导致被害华山松树势迅速衰弱。真菌与华山松大小蠹的共生不仅使真菌成为致死寄主的主要原因, 也使真菌成为华山松大小蠹在韧皮部内成功定居和大量繁殖的必要条件。