经多年的努力, 我们把苏云金杆菌的晶体毒蛋白(Bt)基因转化入杨树, 获得了抗虫的转基因欧洲黑杨(田颖川等, 1993), 并表现出明显的杀虫效果。但随之而来的是考虑到带有Bt基因花粉的广泛传播必然会导致外源基因的扩散, 虽然尚不知外源基因扩散对林木群体及周围个体会产生何种后果, 可是转基因植株花粉显然会对周围环境造成一定程度的污染。为此, 我们仍从基因工程角度出发, 设计一个花期特异性表达, 且能导致花粉败育的基因, 再转入抗虫转基因欧洲黑杨, 从而从根本上消除转基因花粉污染环境的可能。

从有关植物生理学和细胞学研究中发现, 花粉绒毡层发育异常可使花粉不能正常发育下去, 绒毡层是花药组织中花粉发育的周壁层, 在花粉发育中起营养作用, 发育所需的物质必须通过绒毡层运输及合成, 且绒毡层中产生的胼胝质酶可以降解小孢子的胼胝质壁, 该酶表达的时机对花粉的正常发育十分重要, 绒毡层发育异常会导致花粉败育。Goldberg等发现TA29基因是烟草花粉绒毡层高度特异表达的基因(Seurick et al., 1990), 用TA29基因启动子(pTA29)与Barnase基因构成pTA29-Barnase嵌合基因, 转化植株获得人工雄性不育系, 可用于植物杂交育种。1990年和1992年Mariani等首先证明该嵌合基因在烟草和油菜中表现高度花药特异表达, 并获得了雄性不育系(Mariani et al., 1992), 1993年比利时学者Reynaerts A.等用同样方法在花椰菜(Cauliflower)、Witloof Chicory (比利时种植的一种蔬菜)、莴苣(Lactuca Sativa)等作物上也都获得了雄性不育系(Reynaerts et al., 1993)。后来, 在白菜和棉花上也取得了成功(Leemans et al., 1991)。而该基因在林木方面的应用, 尤其是以林木基因工程植株为受体的研究尚未见成功的报道。本课题组构建了人工雄性不育基因表达载体, 并对其进行适当的改造, 使之更适合在林木中表达, 应用于林业生产。

1 材料和方法 1.1 材料及试剂来源

欧洲黑杨转基因植株15-n-192 (田颖川等, 1993)试管苗, 在生根培养基MS₂ (1/2MS+NAA0.02mg/L)中, 每8周继代1次, 取发育4~6周试管苗、顶端下数第3~5片幼叶为试材; Taq酶购自华美生物工程公司, dNTPs为美国Promega公司产品。α-32P-dCTP由亚辉生物工程公司提供。Prime-α-Gene Labelling System随机引物标记探针试剂盒也为Promega公司产品。Barnase基因的两端引物:

1.2 植物遗传转化及转化植株再生 1.2.1 基因枪法转化

幼叶在加0.4M山梨醇的MS₁ (MS+BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L)培养基中培养16h, 用包裹质粒DNA的金弹轰击, 每皿轰击1~2次。金弹包裹方法:取50μL金粉悬液(600mg/L)于1.5mL eppendorf管中, 加入5μL DNA (1μg/1μL)混合, 再加入50μL 0.2M CaCl₂和20μL0.1M亚精胺混合均匀, 离心去上清液; 加250μL无水乙醇混合, 离心去上清液; 加60μL无水乙醇重悬, 5~10μL一枪。

轰击后的叶片转到MS₁培养基上恢复培养5d, 然后转入含有除草剂5mg/L的MS₁培养基中筛选培养。同时, CK₁试管苗叶片切出刀痕转入含有除草剂5mg/L的MS₁培养基中; CK₂试管苗叶片切出刀痕转入MS₁培养基中。

1.2.2 叶盘法转化

转化方法参照文献[1], 转化后共培养48h加羧苄青霉素(car)。

1.2.3 植株再生、扩繁及移栽

转化叶片分化出不定芽, 生长到1~2cm时转入MS₂中生根培养, 同时, 部分用于增殖、扩繁, 生根后的转化植株试管苗合理移栽、管理, 5月份移入苗圃。

1.3 转基因植株总DNA的提取

取10~20mg幼嫩叶片, 置于1.5mL eppendorf管中, 加入400μL研磨缓冲液(15%蔗糖, 250mM NaCl, 50mM EDTA, 50mM Tris), 研磨, 离心去上清液; 400μL (25mM EDTA, 250mM NaCl, 0.5%SDS, 250mM Tris), 于70℃下水浴20min, 加入等体积酚仿抽提, 上清液加2/3体积异丙醇, 离心5min, 去上清液; 用70%乙醇400μL清洗两遍, 去乙醇, 空气干燥后, 样品溶于50~100μL TE (10mM Tris, 0.1mM EDTA)中。

1.4 PCR法检测转基因植株

按如下反应体系进行PCR反应。

用于扩增PCR反应程序为:94℃预变性4min, 然后94℃变性1min, 55℃退火1min, 72℃下延伸2min, 共30个循环; 最后在72℃下延伸8min。

1.5 Southern Blot检测转基因植株

探针的标记:从携有Barnase基因的质粒上切下Barnase基因片段, 电泳回收, 以此为模板, 采用寡聚核苷酸随机引物延伸法(Primer-α-Gene.Labelling System, Promega), 用α-32P-dCTP制备放射性探针, 按《分子克隆》上之方法进行Southern Blot反应、分析。

1.6 Dot Blot检测转基因植株

将植物总DNA直接点到尼龙膜上, 30℃烘干, 用α-32P-dCTP标记的探针进行杂交, 并于-70℃下放射自显影3d。

2 实验结果 2.1 Barnase转基因杨树的获得

通过基因枪法遗传转化, 获得转Barnase基因欧洲黑杨转基因植株, 见表 3。研究发现:基因枪对转化受体有一定要求, 过于幼嫩叶片, 轰击后, 损伤严重, 失去再生能力; 而老叶片转化后再生不易, 故选择合适发育状况叶片至关重要。此外, 叶片被金弹轰击后, 叶片表面有均匀弹孔, 经短期培养后, 弹孔处分化出大量芽点, 很快发育成不定芽, 而CK₂未被轰击, 只是用刀划痕, 其不定芽明显少于轰击叶片, CK₁不耐除草剂而被其杀死(表 3)。

2.2 PCR检测分析

转化植株的PCR分析见图 1。如图 1所示, 348、349、350、355号转化植株的基因组都扩增出一条大小在350bp的DNA片段, 和Barnase基因的大小一致。结果见表 4。

由表 4可见, 基因枪法得到的130株转化株, 经PCR分析有21株呈阳性, 转化频率为16.1%, 叶盘法得到的35株转化植株, 经PCR分析有8株呈阳性, 转化频率为23%。

2.3 Southern Blot分析

转化株的Southern Blot分析见图 2。如图 2所示, 第349号转化植株有一条明显的杂交带, 表明第349号杨树的基因组中携有Barnase基因片段, 可以确定为阳性转化植株。

2.4 Dot Blot分析

转化植株的Dot Blot分析见图 3。如图 3所示, 第349号转化植株有一明显的杂交斑, 从而可以进一步证实第349号为阳性转化植株。

3 讨论

在现代基因工程育种技术中, 通过转Barnase基因, 在花药特异性表达RNA酶基因导致花粉败育, 创造植物雄性不育主要用于农作物杂种优势的利用而关于Barnase基因在林木上的遗传转化研究极少, 尤其是利用转化Bt基因欧洲黑杨工程植株为受体转化雄性不育基因, 导致转基因植株花粉不育, 使转基因植株开花时, 不必顾虑带有Bt基因花粉的传播会导致外源基因的扩散, 从而消除人们对林木转基因植株花粉污染环境的忧虑。本课题的成功研究, 使林木转基因植株能够安全地、广泛地应用于生产, 不产生任何负作用, 并能带来巨大的效益。

在林木遗传转化过程中, 除合理选择适当的发育试材外, 遗传操作技术和方法也是至关重要的。研究发现, 被基因枪轰击后的叶片, 叶面上弹孔伤口处, 容易分化不定芽, 再生完整植株; 而将叶片用刀划痕, 也能有不定芽点发生, 但明显少于轰击叶片, 未划伤叶片, 几乎未见不定芽点出现, 可能是划伤叶片处易发生少量愈伤组织, 在合适培养条件下, 诱导分化出不定芽, 从而提高了转化频率, 利于目的基因成功地转化。研究表明, 如果用基因枪法将不带质粒的DNA空弹轰击叶片, 然后, 用叶盘法转化该叶片, 即将两种方法结合起来, 可大大提高转化频率。此外, 也可用此法对植物各种器官进行轰击, 如胚、叶柄、茎、愈伤细胞团等组织, 以提高转化受体的再生能力, 该方法我们正应用于杨树茎尖、冬芽的遗传转化中。

杨树转Barnase基因转化植株分子鉴定的PCR法、Southern Blot法和Dot Blot法3种方法检测结果表明:PCR方法可以用来初步检测转化植株, 该法快速简单, 并可避免操作对人体有害的药品, 但有较多的假阳性; 用Southern Blot法和Dot Blot法可以准确地检测阳性转化植株。相对而言, Dot Blot更为简单快速, 但不能检测出目的基因片段的大小, 而Southern Blot法不但可以测出目的基因的大小, 而且可以准确地测出目的基因在宿主基因组中的插入位点数。

花粉发育是一个极其复杂的过程, 许多基因与花粉发育有关, TA29是花药绒毡层特异表达的启动子, Mariani等将分离到的Barnase基因与TA29启动子融合转化烟草发现, 92%转化pTA29-Barnase基因的植株(106/115)不能产生花粉, 通过花粉切片比较, 不能产生花粉的转基因植株, 其花药皱缩, 颜色灰暗, 见不到花粉粒, 这些植株不能长出果实和种子, 但如果用未转化的正常植株的花粉授粉, 又能正常结实。分析表明, 是因为Barnase在花药特异表达, 破坏了花药绒毡层, 使花粉不能正常发育, 导致雄性不育。从理论上讲, 转Barnase基因工程植株产生的花粉, 可不必顾虑其基因的扩散, 但在生产实际中, 还需要结合林木常规育种方法, 进一步研究转基因植株的育性、生长发育等诸多实际问题, 使基因工程植株能安全稳定高效地推广于生产造福于人类。