草决明(Cassia tora)为豆科植物，广泛分布于热带和亚热带地区，在我国安徽、广西、四川、浙江、广东等地栽培面积较大。其干燥成熟种子即决明子，是中医临床最常用药材之一。该药材具有祛风散热、清肝明目、润肠通便的功效，主要成分有蒽醌类、萘并吡喃类、多糖类化合物及锌、锰等多种微量元素(贾振宝等，2006)。研究表明：其具有降压、降血脂、抗菌等作用，尤其对高血压、高血脂等心血管疾病疗效较好。由于良好的降脂效果，目前又成为减肥用品中的最常用组分，是国家卫生部公布的69种药食同源的植物之一(吕翠婷等，2006)。

草决明在我国栽培历史悠久，但国内对该药材的研究主要集中在分类鉴定、内在质量、有效成分、药理作用及作用机制等方面(张颖等，2004；张加雄等，2006)，对其栽培过程中的病害问题研究很少。作者于2006—2008年，在山东农业大学药材试验站种植的草决明荚果上发现一种新病害，该病害可造成10%以上荚果受害，危害严重。本研究对病害的病原进行系统研究和鉴定，以期为病害的控制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 标本采集及病原菌分离

病害标本分别采自山东农业大学中药材试验站和山东农业大学园艺试验站。

病原菌的分离和纯化采用组织分离方法，置PDA培养基上于25 ℃恒温培养，待菌落长出后，挑选形态一致的菌落转入PDA平板继续培养，观察菌落形态。

1.2 病原菌形态观察

在体视显微镜下检查采集的病荚，观察拍摄分生孢子器在病荚表面的分布。选取具有典型症状的草决明病荚标本，采用徒手切片法切取子实体，显微镜下观察病菌分生孢子器和分生孢子形态，分别测定100个分生孢子器和分生孢子，计量分生孢子器及分生孢子大小。

1.3 致病性测定

采用离体菌丝块接种法对分离菌株进行致病性测定。选取健康未成熟的草决明幼荚，用75%的酒精表面消毒，将PDA平板上培养4 d的培养物用直径6 mm的打孔器在菌落边缘打出菌饼，采用无伤和刺伤进行接种。无伤接种是将菌饼直接贴接于幼荚表面，刺伤接种用一次性注射器针头在健康幼荚表面针刺后，将菌饼贴接于刺伤部位，每处理接种10个幼荚，以PDA琼脂块同样处理接种为对照。25 ℃培养箱内保湿培养。接种2 d后移去菌丝块，观察发病情况。根据柯赫氏法则，对发病草决明荚再分离病原菌，观察分离的病菌是否与原接种菌株相同。

1.4 病原菌生物学特性 1.4.1 病原菌对温度的适应性研究

分设10，15，20，25，28，30，35 ℃ 7个温度梯度，取直径5 mm的菌落圆片置于PDA培养基上，于上述温度下恒温培养，间隔24 h测量菌落直径，并观察菌落生长形态、颜色等。每处理重复3次。

1.4.2 病原菌对酸碱度的适应性

培养基灭菌后，分别调节pH值为3，4，5，5.5，6，7，8，9，接菌后于25 ℃恒温培养箱中培养，间隔24 h测量菌落直径，计算日生长量，观察菌落生长形态、颜色等，每处理重复3次。

1.5 ITS区的PCR扩增与序列分析 1.5.1 基因组DNA的提取

选择菌株SDAU08-1，将病原菌接种到铺有无菌玻璃纸的PDA平板，5 d后收集菌丝，CTAB法提取纯化基因组DNA，用于PCR扩增。

1.5.2 PCR扩增及序列测定

采用真菌核糖体DNA (rDNA)通用引物，ITS1和ITS4进行扩增，引物序列分别为ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(上海生工生物工程有限公司合成)。PCR循环设置如下：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，设30个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。所用试剂购自上海生工生物工程有限公司。

用胶回收试剂盒(Takara公司)回收正确片断，连接pMD-18-T载体(Takara公司)，转化大肠杆菌DH-5α，PCR法筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定正确后，由上海博亚生物技术有限公司测序。

1.5.3 序列分析与数据处理

测序后，菌株的rDNA-ITS序列与GenBank核酸数据库中相关菌株进行相似性比较，用DNAMAN软件构建系统发育树，分析该菌与其他菌株的关系。

2 结果与分析 2.1 草决明荚枯病症状

该病主要为害草决明的荚果，均从荚果的顶(尖)端开始发病。发病初期在荚果的顶端形成暗绿色、水渍状长条形斑，病斑凹陷，并迅速环绕整个荚果。病斑沿荚果的顶端逐渐向内扩展，形成边缘褐色，中部灰褐色至灰白色的病荚，荚果发病部分明显凹陷，不膨大。有时病斑边缘暗绿色，病健交界处不明显，病部明显缢缩(图版Ⅰ-A，箭头所示)。后期在发病部位密布黑色小颗粒，排列不规则。病部可延伸至整个荚果的1/2，导致病部以上的荚果枯死(图版Ⅰ-A)。荚果发病部分很少形成籽粒，发病较轻者偶有籽粒形成，但籽粒干瘪、黑褐色、表皮不光滑(图版Ⅰ-C)。根据病害症状，将该病命名为草决明荚枯病。

2.2 病原菌鉴定 2.2.1 病原菌形态特征

在解剖镜下镜检田间自然发病的荚果，发现病原菌分生孢子器黑褐色，初埋生寄主表皮下，后突破表皮部分外露(图版Ⅰ-E)。分生孢子器多为单生，单腔室，扁球形或球形，有孔口，大小约(110.12~154.28)μm ×(82.74~150.23)μm，平均(129.67~114.27)μm。内壁生分生孢子梗，孢子梗无色，不分支(图版Ⅰ-F，G，B和C)。分生孢子梭形，单胞，无色，顶端钝圆，基部平截(图版Ⅰ-H)，大小为(16.83~24.55)μm×(5.27~8.17)μm，平均(18.35 ×6.34)μm。

2.2.2 病原菌培养性状及生物学特性

将分离获得的不同菌株在PDA培养基上培养，共获得11株长势一致的分离物。各分离物在PDA培养基上生长迅速，培养初期菌丝白色、疏松、棉絮状，气生菌丝发达，易纠结，菌落边缘整齐或不整齐。培养3 d后，菌落逐渐变成灰色，10 d左右，菌落呈深灰色至黑色，镜检发现，菌丝初期无色，后为深褐色，菌丝粗细不匀，分枝发达，有隔。

从病原菌对温度、酸碱性适应性方面对该病菌的生物学特性进行初步分析，结果表明：病菌在10~35 ℃范围内均可生长，但在20~28 ℃时菌丝生长迅速，4 d后即可长满培养皿，其他温度下生长较慢。pH测定表明，该菌在pH4~9均可生长，但在pH5.5~6.5生长最好，菌丝生长速度快，其他pH条件下生长相对较差。因此，该菌生长适温范围为20~28 ℃，适宜的pH范围为5.5~6.5。

2.2.3 致病性测定

菌丝块法接种结果表明：经针刺接种的荚果，3 d后开始出现病斑，病斑初期暗绿色，水渍状，随后继续扩展形成暗褐色梭形斑。而无伤贴接菌丝块的荚果只有2个荚果表现轻微的水渍状，且水渍状未进一步发展，对照处理也未产生任何症状。从发病荚果上再分离的病菌与原接种菌株培养性状相同，证实原接种菌株为草决明荚的致病菌。

2.2.4 ITS序列分析

为明确草决明荚枯病菌的类群，在形态鉴定基础上，进一步采用分子生物学方法进行鉴定。利用真菌ITS1和ITS4通用引物，对草决明荚枯病菌SDAU08-1的基因组DNA进行PCR扩增，在580bp左右扩增出一条单一条带。经序列测定，该片段大小为583bp。将该序列与GenBank中已有的DNA序列进行同源性比较，发现与其同源性在95%以上的菌株共101个。其中，Botryosphaeria dothidea 87个，B. corticis 4个，B. populi(基因登录号：51094087)1个，其他类群如Physalospora pyricola，Dothiorella gregaria，Dichomera saubinettii(Fusicoccum aesculi)，Macrophomina phaseolina等9株。所有B. dothidea菌株的rDNA ITS序列与SDAU08-1的同源率均在98%~100%，其中12株与该菌的同源率为100%。所得最大分值(Score)为1077 bits，分别为来自中国的石榴干腐病菌B. dothidea(基因登录号：gi:183238643)和石榴疮痂病菌B. dothidea(基因登录号：gi:168810882)。同源性较低的有Macrophomina phaseolina(分值为935)和Rhizoctonia bataticola(分值为928)，同源率均为95%。

用DNAMAN软件建立该菌与其他15个代表菌株的系统发育树，结果如图 1。菌株SDAU08-1的序列与GenBank中8个B. dothidea位于系统发育树的同一分支，遗传距离最近。与其他两个B. dothidea(登录号：89994162和89994163)及无性态的D. saubinettii即Fusicoccum aesculi(登录号：58614359)和B. populi(登录号：51094087)相对较近。而与D. gregaria(登录号：187472357)及P. pyricola(登录号：187472378)相对较远，与B. corticis(登录号：83270252)遗传距离最远。

根据上述病原菌的形态特征以及ITS序列同源性比较的结果，初步鉴定草决明荚枯病的病原菌为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea Ces et de Not.)。其分类地位属于子囊菌门(Ascomycota)、腔菌纲(Loculoascomycetes)、格孢腔菌目(Pleosporales)、葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)，葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)。

3 结论与讨论

本研究通过对该病害病原菌的致病性测定、病原菌的形态观察和rDNA的ITS序列分析，确定该病原菌为葡萄座腔菌，将该病害命名为草决明荚枯病，这在国内外为首次报道。

葡萄座腔菌属(Botryosphaeria spp.)真菌是世界性分布的病原菌，由它引起的植物病害在世界20多个国家流行危害，主要引起多种木本植物的枝干和果实病害，如危害杨树(Populus)、苹果(Malus)、石榴(Catunaregam)、桃树(Prunua)等的枝干而导致溃疡、干腐、流胶，为害果实则导致果实腐烂等症状(张星耀等，2006；余仲东等，2002；付娟妮等，2007)。有关该类真菌在药用草本植物上引起的病害报道较少。B.dothidea在草决明上的症状非常单一，目前主要发现危害荚果，而在发病植株的茎杆和叶片等部位未发现症状，与木本植物上的多种症状类型差异较大。由草决明荚枯病的症状还可以看出，该病菌在荚果上仅发现无性态的分生孢子器和分生孢子，未发现有性时期的结构。从GenBank比对结果看，在101个与SDAU08-1同源性95%以上的菌株中，87个为B.dothidea，且同源率均在98%~100%，DNAMAN构建的系统发育树也表明，该菌与B.dothidea位于系统进化树的同一分支，表明引起草决明荚枯的病菌其有性时期为B.dothidea。

Botryosphaeria属真菌无性时期的分类鉴定较为复杂，该属真菌曾先后与多个半知菌属相联系，因此很难把有性型和无性型正确地对应起来。由于该菌的无性型特征如分生孢子颜色、分隔、分生孢子果的形态等都是可变的，因此仅依靠形态特征进行分类容易发生混淆(Butin, 1993)。赵嘉平等(2007)认为Botryosphaeria无性阶段可能分别对应于色二孢属(Diplodia)和壳梭孢属(Fusicoccum)，而我国林木病理学界曾广泛使用无性型D. gregaria。王金利等(2005)综合分析以前的研究结果后认为，B. dothidea的无性型应该是F. aesculi而不是D. gregaria。本研究中，草决明荚枯病菌SDAU08-1菌株在基于rDNA-ITS序列的系统进化树中，与分离自桉树的D. saubinettii即F. aesculi(登录号：58614359)的遗传距离更为接近，表明该病原菌的无性型可能为F. aesculi，有关这方面的研究正在进行中。