晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant，LEA)是在植物种子发育过程中形成的一类低分子质量蛋白，受发育阶段、ABA和脱水信号等调节(Bray, 1997; Shinozaki et al., 1996)。LEA蛋白含有大量的极性氨基酸和无规则结构，具有很高的亲水性和热稳定性(Close et al., 1993)。根据氨基酸序列的同源性和基序，把LEA蛋白分为6组(张木清等，2005)，其中第2组的脱水素不仅存在于高等植物，也存在于藻类、酵母和盐细菌中(Svensson et al., 2002)，分子质量为9~200 ku(Sarhan et al., 1997)，在C端或其附近具有一个或多个富含赖氨酸的基序，约15个氨基酸残基(EKKGIMDKIKEKLPG)组成，其中KIKEKLPG在不同物种间极为保守，称为K-片段；通常N端有一保守基序(Y-片段)，K-片段与Y-片段之间还有一可被磷酸化的约6个丝氨酸串联的S-片段，称“YSK速记”(Close, 1996)。所有的脱水素不一定含有Y-和S-片段，但都含有K-片段，它是第2组LEA区别于其他组的特征(Allagulova et al., 2003)。K-片段可形成两性的α-螺旋结构，可分别与一些生物膜的脂质体表面暴露的疏水区结合及部分变性蛋白质结合(Ismail et al., 1999)。脱水素的作用主要为：1)作为渗透调节物，在干旱、冷、盐分等胁迫时与糖醇类等协同增加蛋白质、生物膜表面的水化程度，可部分代替水分子，并降低溶质势，保持胞质的溶解状态，稳定细胞结构、尤其是膜结构；2)作为分子伴侣，在脱水胁迫时防止高浓度盐引起蛋白复合体解离成亚基，稳定和保护蛋白质的结构和功能；3)因富含组氨酸，可结合铜、锌、镍等重金属离子，从而清除活性氧组分，保护膜结构免受活性氧的伤害(Hara et al., 2005)。近成熟期油茶种子的水分含量快速下降，为确保其生理活动的正常进行，应有大量的脱水素来维持其适宜的胞内微环境。作者构建的油茶近成熟种子cDNA文库中含有23条脱水素EST，为高丰度表达(谭晓风等，2006)。不同物种脱水素成员的Y-片段是一个变数，油茶脱水素成员EST的N端有1~2个Y-片段，因目前没有油茶脱水素序列的报道，不能确定其完整的CDS(coding sequence)中Y-片段的具体数目。本文对其中的一个单克隆进行5′-RACE，以期获得EST序列中5′端可能缺少的DNA序列信息，方便RNA干扰的功能分析等试验，并根据推导的氨基酸序列对该脱水素的部分性质与功能进行了预测。

1 材料与方法 1.1 材料

中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室构建的油茶近成熟种子cDNA文库，所有单克隆保存于-70 ℃冰箱中，油茶优良无性系湘林1号和湘林4号的近成熟种子采自湖南省林业科学研究院油茶采穗圃。

1.2 方法 1.2.1 质粒DNA提取

SDS碱裂解法的小量制备(萨姆布鲁克等, 2002)。

1.2.2 文库中1743号克隆的EST序列长度的PCR检测

PCR反应体系(20 μL)：Taq(5 U·5μL^-1)0.2 μL，10×PCR buffer2.0 μL，MgCl₂(25 mmol·L^-1)1.2 μL，dNTPs(10 mmol·L^-1)0.4 μL，T3、T7引物各0.8 μL，质粒模板0.2 μL，ddH₂O14.4 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35个循环；72 ℃继续延伸5 min；4 ℃保存。取2 μL扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。

1.2.3 测序

由上海英俊生物技术有限公司进行T3和T7双向测序，应用VectorNTI软件进行校正和拼接以得到该克隆的EST全序列。利用在线的GenBank资源，采用Blast方法对该序列进行比对分析。

1.2.4 总RNA提取

采用Invitrogen公司的RNA提取试剂盒：PureLink ^TM Micro-to-Midi Total RNA Purification System (Catalog No. 12183-018)，按照说明指南进行。

1.2.5 RT-PCR与5′-RACE

用Clontech公司的SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒(Cat.No.634914)，按其说明合成cDNA第一链。基因特异的5′-RACE引物设计如下：

反向引物GSP 5′-TACCAGTATGGTGAACCGGGTTTCCG-3′ (26 bp，10 μmol·L^-1)；

反向巢式引物NGSP 5′-GAACTGGGTCACCAAATTCGTCGGTT-3′(26 bp，10 μmol·L^-1)。

5′-RACE PCR反应体系(50 μL)及降落PCR(退火温度的降落为72 ℃、70 ℃、68 ℃)扩增程序参照试剂盒的说明进行配制和设置。电泳检测结果为多条非目的条带，保存RACE的反应产物，作为巢式PCR的模板。对巢式PCR优化的扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，72 ℃退火、延伸50 s；72 ℃继续延伸2 min，50个循环；改用TaKaRa公司的LA Taq。巢式PCR反应体系(50 μL)：LA Taq(5 U·μL^-1)0.6 μL，10×LA PCR bufferⅡ5.0 μL，MgCl₂(25 mmol·L^-1)5 μL，dNTPs(10 mmol·L^-1)1 μL，NUP、NGSP引物各1 μL，RACE产物模板1 μL, ddH₂O34.9 μL。

1.2.6 目的条带的回收、T载体连接、转化DH5α、PCR检测及测序

使用安比奥公司(长沙)的DNA回收试剂盒和TaKaRa公司的pMD18-T载体连接试剂盒，按照各自的说明进行DNA目的片段的回收及与含有氨苄青霉素抗性基因的pMD18-T载体的连接，转化DH5α大肠杆菌进行蓝白斑筛选，挑取白色的单菌落培养，抽提质粒进行PCR检测，反应体系(20 μL)为：rTaq(5 U·μL^-1)0.1 μL，10×PCR buffer2.0 μL，MgCl₂(25 mmol·L^-1) 1.2 μL，dNTPs (10 mmol·L^-1)0.3 μL，NUP、NGSP引物各0.5 μL，重组质粒模板0.8 μL，ddH₂O 15.1 μL。循环参数与上述巢式PCR的相同。挑选阳性克隆测序。

1.2.7 生物信息学分析与理化性质的预测

利用NCBI的Blast在线软件和Vector NTI软件进行比对和保守基序的识别，蛋白质理化性质的预测软件为ANTHEPROT Ⅴ4.3。

2 结果与分析 2.1 目的EST序列长度的PCR检测及双向测序结果

油茶cDNA文库中，1743号克隆的EST序列经BLAST软件vecscreen去除载体污染后，确认其大小仅为537 bp，而电泳检测为1 000~1 500 bp(图 1)，除去载体序列后仍大于537 bp，因此已知的这段EST序列未反映该克隆的全部信息。双向测序得到该克隆的全部序列信息表明，该序列长1 034 bp，含72个多聚腺苷酸。ORF分析显示，它有一个最长的ORF，长度为600 bp，编码200个氨基酸，含有2个Y-片段、1个S-片段及2个K-片段(分析见下)。但是，有2类脱水素在N端可能含有多个Y-片段(Close, 1996)，而该油茶脱水素到底有多少个尚不清楚；即使该最长ORF就是完整的CDS，但通过5′-RACE，也可得到其缺失5′-UTR部分，获得更多的序列信息。

2.2 5′-RACE产物及转化子的PCR检测

5′-RACE的结果有4条带(电泳图未示出)，尚不能判定目的条带。以RACE产物为模板进行的巢式PCR电泳结果显示有一条带十分明亮，约200 bp(图 2)。挑取10个白色的单菌落进行PCR鉴定，结果除第4和10个克隆的产物外，其余8个产物大小一致(图 3)，选择其中1个克隆测序。

2.3 DNA及其推导的氨基酸序列分析

原1743号的EST序列经测序拼接后5′-UTR新增13 bp，并未改变ORF的个数，表明1743号克隆的EST中就含有CDS序列，至此，就获得了1个油茶脱水素基因的较完整cDNA序列(图 4)，该序列长1 046 bp，其中CDS长600 bp，编码200个氨基酸，推导的氨基酸序列见图 5。5′-UTR的A与T的含量很高，达66.66%，油茶EST文库中脱水素家族的其他成员普遍如此(数据未示出)，这可能有利于转录时的解链和对胁迫信号的快速应答。

Close(1996)采用YSK的速记形式将脱水素分为5种类型：YnSK₂、Kn、SKn、KnS及Y₂Kn。该油茶脱水素氨基酸序列有如下特征：N端有2个Y-片段，在55 aa处有1个富含苏氨酸(Thr)的区域(Thr-区)，TTGTYGTG在该区位内有1次重复；在116 aa处有6个串联的丝氨酸残基(S-片段)，在130 aa处有1个富含赖氨酸的区段(K-片段)，其中的KIKEKLPG在C端重复1次。CDS内编码Y-片段的115~132 bp与175~192 bp中有3处碱基不同，编码K-片段的481~504 bp与628~651 bp中也有3处碱基不同；编码Thr-区的267~290 bp序列紧挨着自身重复，有一处碱基变化，这段序列在油茶的另一些低丰度表达的同源物中缺失，可能反映了脱水素家族成员的某些进化关系。作者所在实验室油茶cDNA文库中还有大量的脱水素EST，该脱水素首先得到全长克隆，故暂命名为CoDHN1。根据各特征片段的分布及数量，按Close(1996)的分类方法，CoDHN1的速记形式为Y₂SK₂型，属于典型的脱水素类型。有学者提出脱水素所含有的串联丝氨酸残基可被磷酸化，这可能有利于脱水素在核定位方面起作用(Jensen et al., 1998；Goday et al., 1994；Campbell et al., 1997)，对金属离子的结合也依赖于磷酸化(Muath et al., 2003)。K-片段形成两亲性的α-螺旋(Ismail et al., 1999)，因而使脱水素同时具有亲水性和疏水性(Ceccardi et al., 1994)。关于Y-片段与Thr-区的功能目前尚不清楚。

2.4 CoDHN1同源性及保守基序的分析

Blastx相似性比较时共搜索到109条序列，其中E-值在0.01以下的有55条，涉及到18个物种。为便于同源性比较，对于相同物种的多条序列，只取Score值最高的一条。结果表明，Score值最高的2个物种是山茱萸(Cornus sericea)和欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)，都为木本，此外，木本植物还有桃(Prunus persica)、沙棘(Hippophae rhamnoides subsp. sinensis)和绒毛白桦(Betula pubescens)，这也许反映了一个趋势：油茶CoDHN1与其他木本植物脱水素的同源性要高于草本。对18条序列中的前12条进行多重比对(图 6)，发现CoDHN1与各比对序列的特征模块Y区、S区与K区等区域都相对保守，这显示了脱水素的基本特征。保守模块Ⅲ(EDDGQGGRRKK)紧位于S-片段后，它可能有着重要的生物学意义。有学者认为EDD是酪蛋白激酶2的底物序列(Svensson, 2001)，油茶cDNA文库中也存在酪蛋白激酶2亚基的EST(谭晓风等，2006)；EDD后的RRKK是在哺乳动物核仁磷蛋白Nopp140及酵母NSR1中发现的核定位信号结合结构域(Campbell et al., 1997)。同样具有RRKK基序的拟南芥(Arabidopsis thaliana)脱水素RAB17结合到含有SV40抗体的核定位信号的多肽上要依赖于RAB17的磷酸化(Campbell et al., 1997)；还发现在转基因的拟南芥中，RAB17与GUS报告基因的融合体引导GUS到核与细胞质的某些亚细胞器中。酪蛋白激酶2的识别序列中的一些突变结构进一步表明，S-片断的磷酸化是核定位的关键(Jensen et al., 1998)。综上，推测CoDHN1这类脱水素中的基序EDDGQGGRRKK同S-片段一齐可被磷酸化，从而引导这类脱水素至核或某些亚细胞结构中以发挥其生理功能。

2.5 CoDHN1理化性质、二级结构和生理功能的预测

拟南芥脱水素分为酸性脱水素和中性/碱性脱水素，前者富含谷氨酸，后者富含甘氨酸，通常植物脱水素不含或仅含少量的色氨酸与半胱氨酸(Close et al., 1989; Deng et al., 2006)。预测CoDHN1的分子量为21 ku，等电点7.0，为中性脱水素，也富含甘氨酸(20.5%)，不含色氨酸与半胱氨酸，极性氨基酸含量高(83%)，在非极性的氨基酸中，仅脯氨酸较高(5%)。图 7显示该油茶脱水素和其他种类的脱水素一样，是高度亲水的，而高含量的极性氨基酸是脱水素的主要特性，也是其高度亲水的化学基础(Close et al., 1993)。二级结构预测采用PDM算法，含螺旋11%、片层4%、转角34%、卷曲51%。采用其他的算法，卷曲更大，螺旋结构更少，说明CoDHN1同其他物种的脱水素结构一样为不规则(Soulages et al., 2003)。对最长的螺旋(182~193 aa)分析其螺旋轮结构(图 8)，发现在RRMMEKIKEKLP12个氨基酸中有4个疏水性残基位于螺旋轮的同一侧(在α-螺旋的位置为3-4-7-11，符合i、i+3、i+4原则)，其余亲水残基在螺旋轮上位于疏水性残基的另一侧，符合两亲性α-螺旋的特征(Segrest et al., 1990)。脱水素通过其疏水作用与生物膜的脂质成分作用(Close, 1996；1997)，这有助于脱水时稳定细胞结构。磷脂、去垢剂、脱水等促进K-片段形成两亲性α-螺旋(Allagulova et al., 2003; Soulages et al., 2003)。从图 7可看出CoDHN1的易溶性与亲水性的曲线基本一致，对亲水性贡献最大的氨基酸残基分别位于12~39 aa、114~153 aa、172~194 aa，这些区域含有较多的赖氨酸或精氨酸或天冬氨酸，极性强，暗示脱水素可强烈结合水分子，在脱水状态下抑制水分的丧失，提高细胞的耐脱水性；富含苏氨酸和甘氨酸的39~114 aa区域对亲水性贡献小，在氨基酸序列中对应于Thr-区，该片段的苏氨酸含量极高，且多数为2个串联，在油茶cDNA文库中CoDHN1代表一类高丰度表达的脱水素，且TTGTYGT在Thr-片段中发生1次重复，Thr-区不同物种的脱水素间变异大，推测该Thr-区为油茶特有，在油脂合成高峰期的水分亏缺状态下，其作用与多元醇等渗调物相似, 在其结合的生物膜或蛋白质的疏水层周围形成水合层而保护生物大分子脆弱的疏水层。

脱水素的S-片段的磷酸化已被多数研究者所认同，某些脱水素依赖于S-片段的磷酸化而增强对钙离子的吸收(Muath et al., 2003)。通常认为，脱水素的钙离子的结合域富含甘氨酸或脯氨酸以及酸性或水合残基(Muath et al., 2003)，故同样富含甘氨酸的CoDHN1也可能与钙离子结合，同其他结合钙离子的蛋白，如钙网蛋白(calreticulin)、集钙蛋白(calsequestrin)、钙联结蛋白(calnexin)等协同作用，充当其缓冲液以缓解因响应胁迫条件而引起钙离子过高带来的毒害(Muath et al., 2003)。

油茶cDNA文库中有超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)的EST分别为3条、11条、2条、1条(谭晓风等，2006)，间接反映了活性氧种类(ROS)的积累是较多的，并发现一条NADPH氧化酶，这是活性氧分子的来源之一。ROS会给油茶种子细胞带来伤害，那么成熟的油茶种子中肯定存在某些机制来清除ROS。某些金属离子参与了ROS的形成，但高丰度表达的脱水素可结合这些金属离子，从而清除或减轻ROS产生的危害。在蛋白质中通常参与重金属离子结合的氨基酸主要是半胱氨酸和组氨酸。由于脱水素缺少半胱氨酸，则脱水素对金属离子的结合能力取决于组氨酸残基的数量和可接触面，而CoDHN1中的组氨酸含量达5.5%。有强烈的证据显示组氨酸高水平地结合Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Fe³⁺等金属离子(Hara et al., 2005)，且串联的组氨酸结合金属的能力强于单个的组氨酸残基(Gusman et al., 2001)，而2个组氨酸如在一个卷曲的螺旋面上紧靠在一起，这样的螺旋基序His-X3-His表现出更强的金属结合特性(Suzuki et al., 1998)。CoDHN1含有11个组氨酸，有4个形成2个组氨酸-组氨酸对，其中1个为HHQQH(图 5)，属于His-X3-His结构，推测可强烈结合金属离子。此外，在柑橘脱水素CuCOR15清除活性氧的过程中，甘氨酸、赖氨酸与组氨酸残基同时被显著降解，暗示甘氨酸、赖氨酸也可能参与活性氧的清除(Hara et al., 2004)。由此推测，富含甘氨酸、赖氨酸与组氨酸的CoDHN1还可能与结合重金属离子有关，是油茶种子成熟期清除ROS的机制之一。

3 结论与讨论

采用5′-RACE技术首次从油茶cDNA文库中克隆了1条脱水素基因的全长cDNA，该基因长度为1 046 bp，其中5′-UTR与3′-UTR分别长69 bp、305 bp，起始密码子ATG，终止密码子TAA，CDS长600 bp，编码200个氨基酸，其内有多个序列的重复，重复中有少量碱基变化，但除了Thr-区的部分区域外，都未改变氨基酸的编码序列，这些重复可能具有重要的生物学意义。CoDHN1含有2个DEYGNP(Y-片段)、1个SGSSSSSS(S-片段)及2个KIKEKLPG(K-片段)，为典型的Y₂SK₂型脱水素(Close，1996)，具有高度的亲水性，在水溶液中主要采取高度无规则的延伸构型(Soulages et al., 2003)。最靠近C端的K-片段具有两亲性α-螺旋，使脱水素同时与极性和非极性的大分子结合，这种结构是其发挥生理功能基础。CoDHN1结合金属离子和亚细胞定位依赖于S-片段的磷酸化，其高度保守的序列EDDGQGGRRKK有助于脱水素的磷酸化和亚细胞定位。Y-片段的功能尚不清楚。CoDHN1的C端2个K-片段是两亲性α-螺旋，富含极性氨基酸，在细胞脱水时可强烈结合水分子，而富含—OH但亲水性并不强的THr-区可能是在水分亏缺时代替水分子而充当相容性溶剂，也有利于在生物膜或蛋白质的疏水表面形成水合层，从而保护蛋白质的结构与功能，因此CoDHN1是良好的渗透调节物；通过与柑桔(Citrus unshiu)及拟南芥(Arabidopsis thaliana)的脱水素进行比较，预测其在油脂合成高峰期时的脱水状态下可结合重金属离子，如果螯合Ca²⁺，可缓冲因脱水胁迫造成的Ca²⁺的瞬时增高，维持钙稳态；如果结合Cu²⁺、Zn²⁺等，则可清除氧自由基，从而稳定、保护细胞膜的结构和胞内环境(Hara et al., 2004；2005)。

油茶种子在油脂合成的高峰期，细胞处于一定程度的渗透胁迫状态。已在油茶cDNA文库中发现了与渗透胁迫响应的信号转导途径相关的大G蛋白、小G蛋白、磷脂酰肌醇代谢途径的相关酶、钙调素、CDPK及其他蛋白激酶与磷酸酶、14-3-3蛋白(谭晓风等，2006)，推测Ca²⁺、IP₃作为信号转导途径的第二信使在油脂合成期发挥着重要的作用。研究表明，过量表达一些脂肪酸合成酶(如菠菜β-酮酯酰-ACP合酶Ⅲ，KASⅢ)的基因后，脂肪酸的含量反而降低了(Dehesh et al., 2001; Thelen et al., 2002)。因此，从研究油茶优质丰产的角度而言，不能只关注脂肪酸合成途径及脱饱和酶的研究，也要研究这些酶发挥作用的细胞内微环境，信号转导途径的相关酶基因的联系也许是探讨油茶丰产的限制因子的一条有效途径，此外，克隆具有自主知识产权的脱水素抗旱基因无疑对缓解当前日益严峻的干旱形势也具有重要意义。